春砂仁內生真菌Letendraea helminthicola A696的次級代謝產物研究

張 捷，劉洪新，劉昭明，李賽妮，陳玉嬋，章衛民*，郭波紅

1廣東藥科大學藥學院，廣州 510006；2廣東省科學院微生物研究所 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室廣東省菌種保藏與應用重點實驗室 廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣州 510070

中藥砂仁屬于姜科(Zingiberaceae)植物成熟的果實，廣泛分布于中國南方地區，老撾、越南、柬埔寨、泰國。以廣東省陽春市所產的陽春砂仁最為有名，春砂仁具有化濕和胃，理氣安胎等功效[1-3]。寄生于春砂仁根部內生真菌也成為發現結構新穎及活性顯著的研究對象，植物內生真菌是寄居在植物組織與植物共生的真菌種類[4]，植物內生真菌具有豐富的物種多樣性，能產生結構新穎復雜、活性多樣的次生代謝產物，因此已成為發現新天然活性物質的重要資源[5]。真菌Letendraeahelminthicola屬于稀缺的種屬[6]，有研究報道[7,8]表明與海綿相關的該種屬真菌產生了兩個具有污水防治作用的化合物3-methyl-N-(2-phenylethyl) butanamide和cyclo(D-Pro-D-Phe)；Huang等[9]報道了從海蟹腸道真菌Letendraeasp.分離到兩個新的含有苯二氫比喃環和四氫呋喃環骨架的螺環聚酮立體異構體letenketals A和B，經過抗菌和抗腫瘤活性測試顯示幾乎沒有抗菌活性，在40 μM時有較弱的抗腫瘤作用；Xu等[10]從海洋來源的真菌Letendraeasp.5XNZ4-2中分離得到七個新的聚酮類化合物，分別是phomopsiketones D～G和letendronols A～C，其中phomopsiketone E顯示較弱的抑制脂多糖活化巨噬細胞中一氧化氮的產生的活性。本課題組以從春砂仁中分離得到的一株內生真菌LetendraeahelminthicolaA696為研究對象，對其化學成分及抗腫瘤和抗菌活性進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

核磁共振波譜儀(AVANCE Ⅲ型400 MHz或AVANCE Ⅲ型600 MHz，瑞士Brucker公司)；液質聯用儀(12900-6430A三重四級桿型，美國Agilent Technologies公司)；高效液相色譜儀(LC 3000制備型，北京創新通恒科技有限公司)；高效液相色譜儀(LC-20A半制備型，日本島津公司)；YMC-pack ODS-AQ制備柱(250 mm × 20 mm，5 μm)；YMC-pack ODS-AQ半制備柱(250 mm × 10 mm，5 μm)(日本YMC公司)；旋轉蒸發儀(OSB-2100型，日本東京理化器械株式會社)；大容量普通搖床(PZ1000B旋轉式，武漢瑞華儀器設備有限公司)；Sephadexdex LH-20(18～110 μm，瑞典Amersham Bioscience公司)；C18反相硅膠(40～75 μm，日本富士硅化學株式會社)；柱色譜硅膠(100～200、200～300目，山東青島海洋化工廠)；薄層層析硅膠板(GF254，德國 Merck公司)；石油醚、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、甲醇(分析純，廣州化學試劑廠)；甲醇、乙腈、正己烷、異丙醇(色譜純，美國BCR公司)。

1.2 實驗材料

春砂仁內生真菌A696于2016年4月自廣東省陽春市馬水鎮采集的春砂仁根分離得到，春砂仁由廣東藥科大學嚴寒靜教授鑒定為Amomumvillosum。將分離得到的菌株通過液氮凍融法提取菌株的基因組DNA，采用引物ITS1和ITS4擴增其rDNA ITS區，并對產物進行測序，測序結果提交GenBank，登錄號為KU529827，通過BLAST(核苷酸序列比對程序)進行序列比對，結果顯示該菌株與LetendraeahelminthicolaB1A0062SNA2CC1081(GenBank號：KP263123)的序列相似度為100%，因此該菌株被鑒定為Letendraeahelminthicola，菌株保藏于廣東省科學院微生物研究所。

1.3 發酵培養

1.3.1 培養基

發酵培養基為馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PDB)：馬鈴薯 200 g/L、葡萄糖 2%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.15%、VitB110 mg/L、海鹽 0.3%。

1.3.2 發酵條件

在無菌條件下，將活化后的菌株接種至裝有250 mL馬鈴薯葡萄糖培養基的500 mL三角瓶中，在28 ℃、120 rpm條件下振蕩培養5天，獲得種子液。將適量種子液轉接到裝有1.5 L馬鈴薯葡萄糖培養液的3 L三角瓶中，在相同條件下培養20天，共發酵55 L。

1.4 分離純化

將A696菌株發酵液經多層紗布過濾，分別得到濾液和菌絲體。用等體積的乙酸乙酯萃取濾液3次，再減壓回收溶劑后得浸膏7.5 g。浸膏經硅膠柱層析(100～200目)，以石油醚-乙酸乙酯，體積比1∶0→1∶3梯度洗脫，并用薄層色譜(TLC)檢測，合并相似組分，得到7個粗組分Fr.1～7。Fr.1經正相硅膠柱層析(正己烷-乙酸乙酯，體積比20∶1→5∶1)得到Fr.1.2，Fr.1.2通過Ace 5 C18PFP半制備柱(乙腈-水，體積比7∶1，2.0 mL/min)到化合物2(2.2 mg)。Fr.3經硅膠柱層析(正己烷-乙酸乙酯，10∶1→3∶1)得到Fr.3.1，Fr.3.1通過Ace 5 C18PFP半制備柱(乙腈-水，體積比60∶40，2.0 mL/min)得到化合物3(1.2 mg)。Fr.5組分通過硅膠柱正相柱層析(正己烷-乙酸乙酯，體積比10∶1→1∶1)得到Fr.5.1、Fr.5.2和Fr.5.3。Fr.5.1通過Sephadex LH-20純化得到化合物8(3.5 mg)；Fr.5.2通過半制備柱(正己烷/異丙醇，體積比5∶1，2.0 mL/min)得到化合物6(2.4 mg)；Fr.5.3通過C18半制備柱(甲醇-水，體積比45∶55，2.0 mL/min)分別得到化合物5(1.8 mg)，化合物4(1.2 mg)，化合物7(1.5 mg)。Fr.7經正相硅膠柱層析(正己烷-乙酸乙酯，體積比5∶1→1∶3)得到Fr.7.2；Fr.7.2通過Schiral A半制備柱(正己烷-異丙醇，體積比5∶1，2.0 mL/min)得到Fr.7.2.1。Fr.7.2.1經Sephadex LH-20柱純化后得到化合物1(3.1 mg)。

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

圖1 化合物1～8的結構式Fig.1 Structures of compounds 1-8

表1 化合物1的1H NMR和13C NMR數據(CD3OD)

續表1(Continued Tab.1)

圖2 化合物1的1H-1H COSY and HMBC的主要相關Fig.2 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

化合物2棕色油狀物;ESI-MS：m/z291.3 [M-H]-，分子式C18H28O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.84(2H，s，H-2，6)，1.42(18H，s，H-8，8′)，2.87(2H，m，H-9)，2.61(2H，m，H-10)，3.69(3H，s，H-12)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：151.9(C-4)，135.8(C-3)，131.1(C-1)，124.4(C-2，6)，34.2(C-7，7′)，30.9(C-8，8′)，36.3(C-9)，30.9(C-10)，51.5(C-12)，173.6(C-10)。以上數據與文獻[12]報道基本一致，故鑒定化合物2為3-(2,6-二叔丁基-4-羥基苯基)丙酸甲酯。

化合物3黃色油狀物;ESI-MS：m/z175 [M + Na]+，分子式C8H8O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.23(1H，dq，J=6.7，1.4 Hz，H-4)，6.93(1H，d，J=6.7 Hz，H-5)，2.46(3H，s，H3-2′)，2.14(3H，s，H3-3′)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：161.3(C-2)，137.8(C-3)，138.0(C-4)，107.3(C-5)，153.0(C-6)，191.4(C-1′)，25.6(C-2′)17.5(C-3′)。以上數據與文獻[13]對照基本一致，故鑒定化合物3為gibepyrone F。

化合物4無色油狀物;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.41(1H，dt，J=7.1,1.1 Hz)，6.71(1H，d，J=7.0 Hz)，6.61(1H，s，H-8)，2.36(3H，s，H-7)，2.11(3H，s，H-3)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：172.02(C-9)，166.78(C-2)，161.06(C-6)，146.06(C-7)，143.79(C-4)，130.55(C-3)，122.60(C-8)，109.76(C-5)，19.23(3-CH3)，16.09(7-CH3)。上述數據與文獻[14]對照基本一致，故鑒定化合物4為gibepyrone D。

化合物5白色粉末;分子式C7H6O4。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：9.78 (1H，s，H-7)，7.79(2H，d，J=8.6 Hz，H-2，5)，6.93(2H，d，J=8.6 Hz，2H，H-3，5)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：192.8(C-7)，165.2(C-4)，133.4(C-2，6)，130.3(C-1)，116.9(C-3，5)。以上數據與文獻報道[15]基本一致，將鑒定化合物5為對羥基苯甲醛。

化合物6白色粉末;ESI-MS：165 [M-H]-，分子式C9H10O3。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.14(2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6)，6.77(2H，d，8.4 Hz，H-3，5)，3.69(3H，s，OMe)，3.55(2H，s，H-7)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：172.8(C-8)，155.1(C-4)，130.8(C-1)，126.4(C-2，6)，115.8(C-3，5)，52.4(OMe)，40.6(C-7)。以上數據與文獻報道[16]一致，將化合物6鑒定為對甲氧基苯乙酸。

化合物7白色粉末;ESI-MS：m/z175.1 [M+Na]+，分子式為C8H8O3。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：3.55(2H，s，H-7)，7.09(2H，m，H-2，6)，6.74(2H，t，J=7.5，H-3，5)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：176.2(C-8)，156.6(C-4)，131.9(C-2)，129.0(C-6)，122.7(C-1)，120.2(C-3)，115.8(C-5)，36.5(C-7)。以上數據與文獻[17]報道一致，故鑒定化合物7為間羥基苯乙酸。

化合物8棕色固體物質;ESI-MS：m/z395.1 [M-H]-，分子式為C28H44O。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：0.62(3H，s，H3-18)，0.83(6H，d，J=6.4 Hz，H3-26,H3-27)，0.9(3H，d，J=6.9 Hz，H3-28)，0.94(3H，s，H3-19)，1.03(3H，d，J=6.7 Hz，H3-21)，3.63(1H，m，H-3)，5.19(2H，dd，J=9.2，7.1Hz，H-22/H-23)，5.38(1H，m，H-7)，5.57(1H，m，H-6)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：12.2(C-18)，16.4(C-19)，17.8(C-28)，19.8(C-21)，20.1(C-26)，21.2(C-11，C-15),23.1(C-27)，28.4(C-12)，32.1(C-2)，33.2(C-25)，37.1(C-10)，38.5(C-1)，39.2(C-16)，40.6(C-20)，40.9(C-4)，42.9(C-24，C-13)，46.3(C-9)，54.7(C-14)，55.8(C-17)，70.6(C-3)，116.4(C-7)，119.7(C-6)，132.1(C-23)，135.7(C-22)，139.9(C-8)，141.5(C-5)。以上數據與文獻[18]報道的基本一致，故鑒定化合物8為麥角甾醇。

2.2 細胞毒和抗菌活性測試

采取SRB法[19]測試化合物1～5對四種腫瘤細胞株包括人神經癌細胞(SF-268)、人乳腺癌細胞(MCF-7)、人肝癌細胞(HepG-2)和人肺癌細胞株(A594)的細胞毒活性，結果顯示：化合物1～5在100 μg/mL下對四種腫瘤細胞株的增殖抑制率均在20%以下，陽性對照為順鉑(IC50：3.20 μM)，表明無細胞毒活性。

采用微量稀釋法[20]測定化合物1～5對銅綠假單胞桿菌CMCC10104(Pseudomonasaeruginosa)、大腸桿菌CMCC44102(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌CMCC26003(Staphylococcusaureus)和枯草芽孢桿菌CMCC63501(Bacillussubtilis)的抗菌活性，結果顯示化合物1～5在濃度為100 μg/mL時對上述受試菌的抑制率低于40%，陽性對照為氨芐西林(MIC：1 μg/mL)，表明化合物1～5無抗菌活性。

3 討論與結論

真菌Letendraeahelminthicola屬于稀缺的微生物種屬，本文是關于該屬真菌關于次級代謝產物的第四次報道，該屬真菌產生過二酮哌嗪類、螺環聚酮類化合物[7-10]，本研究從春砂仁內生真菌A696發酵液中分離得到8個單體化合物，豐富了該屬真菌的次級代謝產物類型，其中化合物1為新的倍半萜類化合物；化合物2是一種抗氧化劑，也是合成抗氧化劑1076和1010等的主要原料；化合物3和4均為α-吡喃酮結構化合物，化合物3被報道是首次從天然產物中分到的α-吡喃酮結構，通常以gibepyrone B為原料進行合成；化合物5、6、7均為芳香苯環小分子化合物；化合物8為麥角甾醇，在醫藥化學上已經得到應用，已經做為維生素D2的前體，也是生產激素類藥物中間體。該菌的粗提物顯示一定的抗菌抗腫瘤活性，但化合物1通過活性測試發現沒有抗菌和抗腫瘤活性，很可能是一些具有抗菌抗腫瘤活性次級代謝產物并沒有從粗提物中成功分離到。因此，可以從發酵產物量上進行大規模發酵，以期得到活性次級代謝產物；本次液體發酵的時間長達20天可能也是導致培養基中產生一些結構簡單的基本代謝產物的原因，這為以后的發酵時長提供前車之鑒；另一方面，研究表明倍半萜類化合物具有抗菌、抗癌、殺蟲、調節植物生長等活性[21]，今后可以對該化合物進行其他活性測試，以挖掘該化合物其他的生物活性。