九蒸九曬熟地黃中的紫羅蘭酮類化合物

張靖柯，呂錦錦，李 孟，魏俊俊，鄭曉珂，馮衛生

河南中醫藥大學 河南省中藥開發工程技術研究中心，鄭州 450046

地黃是玄參科地黃屬植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根，在中國傳統用藥中具有幾千年的藥用歷史。產地主要集中在河南、山西、山東等地，以河南焦作為其道地產區，目前各地也多有栽培。在臨床用藥中，地黃有鮮地黃，生地黃以及熟地黃三種飲片形式，其臨床應用以及藥性藥效均存在較大的差異。鮮地黃味甘，性苦、寒。歸心、肝、腎經。具有清熱生津，涼血止血的功效。生地黃味甘性寒。歸心、肝、腎經。具有清熱涼血，養陰生津的功效。熟地黃Rehmanniae Radix Praeparata為生地黃的炮制加工品，味甘性微溫，歸肝、腎經。補血滋陰，益精填髓[1]。前期課題組對鮮地黃、地黃葉以及生地黃都進行了系統的化學成分研究[2-6]，并且從九蒸九曬熟地黃中也分離得到了6個生物堿類化合物[7]。目前研究報道熟地黃主要含有多糖類[8]，苯乙醇苷類[9]、核苷類[10]、環烯醚萜類[11]、紫羅蘭酮類[12]以及多種微量元素等化合物。熟地黃現代藥理活性主要表現為抗腫瘤、抗氧化應激、抗抑郁和抗突變[13-16]等方面的作用。

紫羅蘭酮類化合物廣泛存在于地黃屬植物中，具有環化異戊二烯結構單元，有較強的抗腫瘤活性[17,18]。有研究表明[19]紫羅蘭酮類化合物對鼠黑色素瘤(B16)細胞具有抑制作用。因此本實驗對從九蒸九曬熟地黃中分離得到的紫羅蘭酮類化合物進行了人黑色素瘤A375細胞細胞毒活性的篩選研究。豐富和完善了“九蒸九曬”熟地黃的相關化學成分研究，并為其開展進一步的抗腫瘤研究提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

Bruker AVANCE Ⅲ 500核磁共振儀(TMS內標)(Bruker)；Bruker maxis HD mass spectrometer,Shimadzu UV-2401PC apparatus；Waters Alliance系列2695高效液相系統；Thermo NicoletIS 10紅光譜儀(美國)；旋光儀(Rudolph，美國)；Thermo EVO 300紫外分光光度計(Thermo Scientific，美國)；LC-52半制備液相色譜儀(賽普銳思科技有限公司)；Reprosil-Pur120 C18-AQ色譜柱(德國)；CHIRALPAK AD-H色譜柱(大賽璐藥物手性技術有限公司)；旋轉蒸發儀(日本，東京理化)；二氧化碳培養箱(上海STIK)；超凈工作臺(蘇凈集團)；倒置顯微鏡(Nikon)。

1.1.2 試劑

柱層析填料Diaion HP-20(日本，三菱化學公司)；Toyopearl HW-40(日本，TOSOH公司)；Sephadex LH-20(瑞士，Parmacia Biotech公司)；柱層析用硅膠(100～200、200～300目)、薄層層析硅膠(青島海洋化工廠)。

甲醇(色譜純，天津市富宇精細化工有限公司)；甲醇(分析純，天津市富宇化工有限公司)；乙腈(色譜純，美國天地有限公司)；A375人惡性黑色素瘤細胞株(中國科學院上海細胞庫)；四甲基偶氮唑藍(MTT)；培養皿(Corning)；E-Plate板96孔板；胰蛋白酶；DMEM高糖培養基(Gibco)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；DMSO(Solarbio)；PBS緩沖液等為自配。

1.1.3 藥材

本實驗所用熟地黃2017年8月購自河南省禹州市青山藥業有限公司(經九蒸九曬方法炮制)，標本(編號20170907)存放于河南中醫藥大學藥物化學實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取和分離

干燥熟地黃飲片10 kg，剪碎后加10倍量70%的含水丙酮加熱回流提取3次，提取液過濾，合并濾液進行減壓濃縮，真空干燥，得到熟地黃總提取物浸膏4.4 kg。將總提物浸膏加3 L水溶解分散，加95%乙醇調節至醇濃度80%進行醇沉，靜置24 h后，取上清液，減壓濃縮得到總浸膏。浸膏加8 L水溶解，然后經Diaion HP-20大孔吸附樹脂柱，依次用水、10%、20%、30%、50%、70%以及95% EtOH進行梯度洗脫，得到7個洗脫組分，即Fr.1～Fr.7。20% EtOH(Fr.3)水溶解后用Sephadex LH-20凝膠柱[甲醇∶水(V/V)=0∶100→100∶0] 梯度洗脫，洗脫組分經薄層硅膠色譜檢識，合并相同組分得到Fr.3-1～Fr.3-4。其中Fr.3-1組分5%甲醇溶解用中壓制備(ODS)柱，甲醇-水系統進行梯度洗脫得到Fr.3-1-1～3-1-3。Fr.3-1-2經半制備液相Reprosil-Pur 120 C18-AQ色譜柱(CH3CN∶H2O=12∶88)流速為：3 mL/min，保留時間(tR=27.87 min)洗脫得到化合物1(3.40 mg)。Fr.3.3溶解后經Toyopearl HW-40C凝膠柱，30%甲醇洗脫得到Fr.3-3-1～Fr.3-3-4。Fr.3-3-2用半制備液相Reprosil-Pur120 C18-AQ色譜柱(CH3CN∶H2O=10∶90)流速：3 mL/min，保留時間(tR=21.36 min)得到化合物2(4.23 mg)。95% EtOH洗脫組分(Fr.7)甲醇溶解后上硅膠柱。用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇依次洗脫得到Fr.7-1～Fr.7-4。其中Fr.7-1經Sephadex LH-20凝膠柱甲醇洗脫，得到Fr.7-1-1。Fr.7-1-1甲醇溶解，進行硅膠柱層析，二氯甲烷-甲醇(40∶1)等度洗脫，最終得到化合物3(7.91 mg)。

1.2.2 細胞毒活性檢測

采用MTT法探究化合物1～3對A375人惡性黑色素瘤細胞株的細胞毒作用[20]。將A375細胞置于培養基中37 ℃，5% CO2培養箱中培養至對數生長期，接種于E-Plate 96孔板中，24 h后，實驗分為正常對照組和三個給藥組?；衔?～3(25 μM)分別刺激A375細胞48 h，通過MTT法檢測各組細胞活力。

1.2.3 統計學分析

利用SPSS 20.0進行數據統計學分析。數據以平均值±標準差表示，分析數據顯著性差異，P< 0.01表明具有極顯著性差異。

2 結果

2.1 結構鑒定

2.1.1 化合物結構鑒定

化合物1無色結晶性粉末； -64.0(c0.02，CH3OH)；HR-ESI-MS：m/z469.203 9 [M+Na]+(calcd for C21H34O10Na，469.204 4)確定化合物的分子式為C21H34O10；UVλmax(CH3OH)/nm(logε)197(0.35)，263(1.05)；IRνmax：3 387、2 929、1 679、1 522、1 459、1 263、1 078、849 cm-1；IR光譜提示存在羥基(3 387 cm-1)和羰基信號(1 611 cm-1)；1H NMR(500 MHz，CD3OD)：δ6.68(1H，d，J=16.1，H-7)和6.39(1H，d，J=16.1 Hz，H-8)提示化合物中存在一個反式雙鍵；δH5.80(1H，s，H-10)推測為雙鍵上的氫信號；δH1.03(3H，s，1α-CH3)、0.89(3H，s，1β-CH3)、0.96(3H，s，5-CH3)以及2.30(3H，s，9-CH3)為四個甲基氫信號；δH4.30(1H，d，J=7.8 Hz,H-1′)為糖的端基氫信號，δH3.85(1H，d，J=11.8 Hz，H-6′a)和3.67(1H，dd，J=11.8，5.3 Hz，H-6′b)為葡萄糖6位特征氫信號，結合δH3.18～3.73(4H，m，H-2′～5′)推測該化合物中存在一個葡萄糖的結構片段。根據偶合常數J=7.8 Hz，判斷該葡萄糖為β構型。13C NMR(125 MHz，CD3OD)共顯示21個碳信號，結合DEPT 135譜可知，δC18.8(1α-CH3)、22.7(1β-CH3)、26.9(5-CH3)和14.3(9-CH3)為4個甲基信號；δC27.0(C-3)，35.9(C-4)，62.8(C-6′)為3個仲碳信號；δC85.4(C-2)，139.3(C-7)，134.6(C-8)，119.7(C-10)，106.6(C-1′)，75.4(C-2′)，78.2(C-3′)，71.7(C-4′)，77.7(C-5′)為9個叔碳信號；δC45.2(C-1)，75.6(C-5)，82.4(C-6′)，153.8(C-9)，170.7(C-11)為5個季碳信號；其中δC170.7為-COOH的特征碳信號，結合其信號特征，推測該化合物可能為倍半萜苷類化合物(見圖1)。將其碳譜數據與文獻[21]中sec-hydroxyaeginetic acid進行對比，發現化合物1中多一組葡萄糖的碳信號(δC106.6、75.4、78.2、71.7、77.7、62.8)且δC74.5(C-2)處的碳信號向低場區發生位移至δC85.4處，根據苷化位移以及HMBC譜，葡萄糖端基氫δH4.30(H-1′)與δC85.4(C-2)處的碳遠程相關(見圖2)，確定葡萄糖連接在sec-hydroxyaeginetic acid苷元的C-2位上。

圖1 化合物1的化學結構Fig.1 The chemical structures of compound 1

圖2 化合物1的HMBC、1H-1H COSY相關Fig.2 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

化合物1的相對構型主要是通過NOESY譜進行確定。在NOESY譜中，δH3.53(H-2)與δH0.82(1β-CH3)、3.78(6-OH)具有NOE關系位于同側，并且3.78(6-OH)與0.90(5-CH3)、δH3.53(H-2)具有NOE相關，由此可判斷H-2/1β-CH3/5-CH3/6-OH空間取向一致為β；同時δH4.14(5-OH)與δH1.04(1α-CH3)具有NOE關系提示5-OH/1α-CH3位于一側為α。由此可以判斷化合物1的相對構型。根據以上解析，確定化合物1的結構。經查閱scifinder未見相關報道，確定為新化合物并將其命名為sec-hydroxyaeginetic acid-2-O-β-D-glucopyranoside，其碳氫數據歸屬見表1?；衔?的詳細結構鑒定數據原始圖譜可從本刊官網免費下載(www.trcw.ac.cn)。

表1 化合物1的1H NMR和13C NMR數據Table 1 1H and 13C NMR spectroscopic data of compound 1

化合物2無定型粉末； -76.5(c0.018，CH3OH)；HR-ESI-MS：m/z323.146 3 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：3.50(1H，d，J=9.8 Hz，H-2)，3.86(1H，m，H-3)，1.90(1H，t，H-4α)，1.81(1H，dd，J=13.0，4.8 Hz，H-4β)，6.68(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)，6.40(1H，d，J=16.0 Hz，H-8)，5.80(1H，s，H-10)，2.30(3H，s，H-12)，1.12(3H，s，1α-CH3)，0.90(3H，s，1β-CH3)，1.07(3H，s，5-CH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：45.6(C-1)，79.4(C-2)，69.3(C-3)，44.1(C-4)，77.1(C-5)，81.9(C-6)，139.3(C-7)，134.8(C-8)，153.7(C-9)，119.8(C-10)，170.6(C-11)，14.2(C-12)，18.9(1α-CH3)，23.3(1β-CH3)，26.9(5-CH3)。以上數據結合文獻[22]，確定化合物為frehmaglutin A。

化合物3無色晶體； -32.1(c0.025，CH3OH)；HR-ESI-MS：m/z249.146 4 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)，δ：1.17(1H，m，H-2a)，1.69(1H，m，H-2b)，1.89(1H，m，H-3a)，1.38(1H，m，H-3b)，1.47(1H，m，H-4a)，1.80(1H，m，H-4b)，7.42(1H，d，J=16.2 Hz，H-7)，6.32(1H，d，J=16.2 Hz，H-8)，δH2.30(3H，s，H-10)，1.24(3H，s，1α-CH3)，0.80(3H，s，1β-CH3)，1.06(3H，s，5-CH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)，δ：39.6(C-1)，37.3(C-2)，18.9(C-3)，36.6(C-4)，75.5(C-5)，80.6(C-6)，153.3(C-7)，131.8(C-8)，201.4(C-9)，δC27.4(C-10)，25.7(1α-CH3)，27.4(1β-CH3)，27.0(5-CH3)。以上數據結合文獻[21]，確定化合物為dihydroxy-β-ionone。

2.1.2 酸水解

化合物1(1 mg)，加入1 mL三氟乙酸溶液(2 mol/L)，加熱回流3 h，所得水解液用乙酸乙酯萃取3次，將水層濃縮至干[23]。加少量乙醇溶解，經HPLC分析采用蒸發光散射檢測器，色譜柱為CHIRALPAKAD-H(250 mm × 4.6 mm)，流動相為正己烷-乙醇-三氟乙酸(750∶250∶0.25)，流速0.5 mL/min。通過比較樣品與D-葡萄糖標準品的保留時間，確定化合物1中葡萄糖的絕對構型為D-葡萄糖(tR=18.3 min，D-glucose)。

2.1.3 絕對構型的確定

化合物1的絕對構型通過與文獻對比ECD圖譜確定。在ECD譜中(見圖3)，222 nm處有一個正的Cotton效應，265 nm處有一個負的Cotton效應，與sec-hydroxyaeginetic acid[21]的ECD圖譜一致從而確定該化合物的絕對構型為2S，5R，6R。

圖3 化合物1的ECD譜圖Fig.3 ECD spectra of the compound 1

2.2 細胞毒活性

本實驗測試了從九蒸九曬熟地黃中分離得到的三個紫羅蘭酮類化合物的細胞毒活性，結果顯示，化合物1～3在25 μM濃度下能顯著性降低人惡性黑色素瘤A375細胞的細胞活力，提示其可能具有抗人惡性黑色素瘤A375細胞的活性(如表3所示)。

表3 化合物1～3對A375細胞活力的影響Table 3 Cytotoxic activity of compounds 1-3 on A375 cells

3 結論與討論

地黃為玄參科地黃屬植物地黃的新鮮或干燥塊根，經炮制加工以鮮地黃，生地黃以及熟地黃三種飲片形式應用于臨床。地黃在炮制加工過程中，其藥性藥效均發生了改變，這種改變可能與其內在化學成分的改變密切相關。有研究表明[24]，炮制加工過程中熟地黃5-羥甲基糠醛(5-HMF)的含量顯著高于生地黃，Zou等[25]利用一測多評法同時測定熟地黃中4種苯乙醇苷研究，結果表明地黃經炮制加工后4種苯乙醇苷成分含量均有所下降。Li等[26]研究表明，生地黃中的地黃苷A和地黃苷D的含量均比熟地黃中含量高。Jia等[14]對鮮地黃，生地黃和熟地黃中水蘇糖在炮制過程中的變化研究，結果表明鮮地黃中水蘇糖含量最高，其次是生地黃，熟地黃中含量最低。Zhang等[27]采用HPLC建立了同時測定了生地黃和熟地黃中5個苷類成分含量的方法，為開展生地黃、不同炮制方法制備熟地黃的藥效物質基礎研究提供了參考。為補充和完善熟地黃的化學成分，尋找地黃在炮制過程中的差異性成分，開展熟地黃相關化學成分研究是非常有必要的。本實驗建立在前期研究的基礎上，對九蒸九曬熟地黃進行進一步的化學成分分離純化研究，分離得到3個紫羅蘭酮類化合物。并對其進行了A375細胞毒活性的初步篩選評價研究。研究結果表明化合物1～3均能顯著的抑制A375細胞活力，具有潛在的抗人黑色素瘤細胞的作用。本實驗為熟地黃中紫羅蘭酮類化合物對人黑色素瘤細胞細胞毒活性的相關機制研究提供參考價值，也為熟地黃藥材的進一步開發利用提供科學依據。