漢黃芩素緩解高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化和NF-κB介導的動脈炎癥反應

韋 磊，王 絢，陳 雄，湛 雯，韓 望*

1南京醫科大學附屬兒童醫院藥學部，南京 210008；2溫州醫科大學附屬第一醫院內分泌科，溫州 325006

動脈粥樣硬化是一種脂質驅動的慢性炎癥性疾病，主要發生在中、大動脈的分支或彎曲部位，是導致心血管疾病的發病率和死亡率增加的主要原因[1]。動脈粥樣硬化是一種多因素疾病，涉及慢性炎癥、氧化應激、遺傳易感性、代謝紊亂、表觀遺傳學和各種非遺傳危險因素(環境污染、吸煙、心理健康、飲食和生活方式)等[2,3]。當內皮功能發生障礙時，單核細胞粘附于內皮并遷移至內皮下隨后分化為單核巨噬細胞，攝取脂質從而形成脂肪條紋[3-5]。隨后，中層血管平滑肌細胞向內皮下間隙遷移，形成粥樣斑塊。當纖維帽覆蓋的壞死核增多時，斑塊容易破裂，導致缺血性中風和心肌梗死等危險事件[4,6]。其中，炎癥在動脈粥樣硬化的發生和發展過程中占據著主導作用[7]。無論在內皮功能障礙和脂紋形成期間，還是在粥樣斑塊形成和斑塊破裂時期，炎癥因子均有著不同程度的釋放[8,9]，但至今具體的機制還未被研究清晰，且臨床缺乏治療方案。漢黃芩素(wogonin)是從黃芩根中提取的一種有效成分，被證明具有多種生物活性，包括抗腫瘤、抗炎、抗菌、心臟保護和神經保護作用等[10-12]。先前有研究報道漢黃芩素可抑制炎癥緩解異丙腎上腺素誘導的心臟損傷[12]；雖然漢黃芩素抗炎活性的作用機制仍不清晰，但細胞核因子κB蛋白(nuclear factor-κB，NF-κB)驅動的炎癥可能是其抗炎的作用靶點[13,14]。為了研究漢黃芩素對動脈粥樣硬化的可能作用與機制，本項目擬觀察漢黃芩素干預治療高脂飲食(high-fat diet，HFD)喂養ApoE-/-小鼠12周后動脈粥樣硬化斑塊發展程度，動脈炎癥以及NF-κB信號通路的激活情況。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

漢黃芩素(批號：632-85-9，南京春秋生物工程有限公司)；油紅O染色試劑盒(美國sigma公司，批號：MKCG9293)；HE染色試劑盒(批號：G1005-500，武漢塞維爾生物科技有限公司)；高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein，HDL)檢測試劑盒(批號：20190809，南京建成生物工程研究院)；低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein，LDL)檢測試劑盒(批號：20190813，南京建成生物工程研究院)；總膽固醇(total cholesterol，TCH)檢測試劑盒(批號：20190814，南京建成生物工程研究院)；甘油三酯(triglyceride，TG)檢測試劑盒(批號：20190813，南京建成生物工程研究院)；逆轉錄試劑盒(批號：H6906340，上海Yeasen公司)；實時定量PCR試劑盒(批號：H7825250，上海Yeasen公司)；Trizol(批號：AI61056A，大連Takara公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物

選擇8周齡的雄性ApoE-/-小鼠(購自集萃藥康生物有限公司，生產許可證號：SCXK(蘇)2018-0008)，18～22 g，SPF級。在本研究中，48只C57BL/6J背景的ApoE-/-小鼠在實驗室馴化2周后開展實驗。

1.2.2 動脈粥樣硬化動物模型建立

將ApoE-/-小鼠隨機分為3組：(1)高脂飲食(能量配比：40%脂肪，40%碳水化合物，20%蛋白質)喂養ApoE-/-小鼠，同時根據文獻[11,12]灌胃給予漢黃芩素(以1%CMC-Na溶液配置成懸濁液，濃度為2 mg/mL)，劑量為10 mg/kg/天，持續12周(HFD+wogonin 10 mg/kg組，n=12)；(2)高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠，同時根據文獻[11,12]灌胃給予漢黃芩素(以1%CMC-Na溶液配置成懸濁液，濃度為4 mg/mL)，劑量為20 mg/kg/天，持續12周(HFD+wogonin 20 mg/kg組，n=12)；(3)高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠(HFD組，n=12)，同時灌胃給予與給藥組等體積的1%CMC-Na溶液；(4)正常飲食(normal diet，ND)(能量配比：10%脂肪，70%碳水化合物，20%蛋白質)喂養ApoE-/-小鼠(ND組，n=12)，同時灌胃給予與給藥組等體積的1%CMC-Na溶液；連續喂養12周。

動物在戊巴比妥鈉麻醉下被處死。小鼠死亡后，解剖動脈并拍照，將動脈組織置于液氮中快速冷凍，進行基因和蛋白質表達分析和/或放入4%多聚甲醛中進行病理分析。此外，在死亡前，用含肝素的注射器從右心室采集血液。

1.2.3 生化指標測定

動物在戊巴比妥鈉麻醉下，收集小鼠血液，用相應的試劑盒根據說明書提示步驟進行實驗，檢測血液中的高密度脂蛋白膽固醇(HDL)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)、總膽固醇(TCH)和甘油三酯(TG)水平。

1.2.4 油紅O染色

處死小鼠后每組收集6只ApoE-/-小鼠整主動脈，對于整主動脈中動脈粥樣硬化斑塊的分析，取心臟主動脈弓至髂總動脈的整個主動脈，將其剝離出并至于封口膜上鋪平后于4%多聚甲醛中固定過夜。次日，先于純水中清洗5 min后，首先用異丙醇配置0.5%的油紅O染液，以純水∶0.5%油紅O染液為2∶3的比例配置油紅O工作液，60%異丙醇預處理動脈1 min，于油紅O工作液染色15 min，再于60%異丙醇浸泡1 min，純水清洗至沒有油紅O染液殘余，觀察主動脈中動脈粥樣硬化斑塊情況，利用Image J分析斑塊面積，斑塊面積=(斑塊面積/鋪平的動脈總面積)×100%。

1.2.5 HE染色

處死小鼠后每組收集6只ApoE-/-小鼠心臟和近端主動脈，于4%多聚甲醛中固定過夜，次日用20%蔗糖脫水12 h后利用冰凍包埋劑制備心臟冰凍切片樣本，切至主動脈根部并收取主動脈三尖瓣切片(8 μm)。將收集主動脈根部的8 μm厚度的冷凍切片于蘇木精染色5 min后，含1%HCL的無水乙醇分化1 min，再于1%氨水的純水返藍1 min，純水清洗5 min，于80%無水乙醇和90%無水乙醇脫水后置于伊紅染色5 min后，繼續后續脫水程序，100%無水乙醇2次，每次5 min，最后于二甲苯浸泡2次，每次5 min后封片觀察組織病理學變化，利用Image J分析斑塊絕對面積與相對面積，相對面積計算方式為斑塊面積=(斑塊面積/動脈管腔總面積)×100%。

1.2.6 實時定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)

每組收集6只ApoE-/-小鼠動脈組織由Trizol提取RNA。根據逆轉錄試劑盒操作說明利用2 ×SuperMix將RNA以25 ℃，5 min；42 ℃，30 min；85 ℃，5 min的程序逆轉錄成cDNA。通過SYBR Green以1 μL cDNA+2 μL 10 μM引物雙鏈+5 μL SYBR Green+2 μL RNase free ddH2O的體系和95 ℃，3 min；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s，×40循環；溶解曲線的程序檢測cDNA的白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)和血管細胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule -1，VCAM -1)的mRNA水平，引物序列見表1。

表1 實時定量聚合酶鏈式反應的引物序列Table 1 Primer sequence of real-time quantitative PCR

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western blot)

每組收集6只ApoE-/-小鼠動脈組織，利用蛋白裂解液裂解組織提取組織總蛋白，通過BCA測蛋白濃度并將每個樣本的上樣總蛋白量保持一致。利用10%SDS膠將所有樣本的蛋白進行分級分離，隨后將蛋白濕轉至PVDF膜上(0.2 μm孔徑的膜用于小分子量蛋白，0.45 μm孔徑的膜用于分子量大的蛋白)。濕轉達90 min后停止然后用5%脫脂牛奶孵育2 h起封閉作用，待封閉結束后TBST洗滌，隨后加入一抗(抗p-NF-κB兔單克隆抗體，抗NF-κB兔單克隆抗體，抗IκB-α鼠單克隆抗體和抗β-actin兔單克隆抗體，均以5%脫脂牛奶的TBST溶液稀釋1 000倍)孵育，于搖床室溫孵育2 h后放至4 ℃過夜處理。第二日TBST洗滌后，用HRP結合的二抗(均為1∶5 000稀釋)孵育1 h，二抗孵育結束后用TBST洗滌3次。利用ECL發光液(A液∶B液=1∶1)與發光成像儀收集圖像并用ImageJ進行灰度分析。

1.2.8 組織免疫熒光染色

每組收集6只ApoE-/-小鼠心臟和近端主動脈，同“1.2.5”方法得8 μm厚度的冰凍切片用以免疫熒光染色分析。首先用5%驢血清白蛋白封閉切片45 min。隨后，將冰凍切片與一抗(抗VCAM-1兔單克隆抗體、抗Moma-2大鼠單克隆抗體，均為1∶200稀釋)在4 ℃下孵育過夜。之后，PBS清洗三次，每次5 min，將帶有Alexa Fluor 488標記的二抗(1∶200稀釋)在室溫下孵育1 h。然后，利用DAPI染色5 min后，PBS清洗三次，每次5 min，封片后顯微鏡下觀察并收集圖像。

1.2.9 統計學處理

2 結果

2.1 漢黃芩素緩解高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化發展

首先我們探究了漢黃芩素對高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的影響。高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠12周后處死小鼠，小鼠解剖圖可觀察到高脂飲食喂養可促使ApoE-/-小鼠主動脈弓處動脈粥樣斑塊的形成(見圖1A)，而根據文獻[11,12]選用漢黃芩素(10 mg/kg和20 mg/kg)處理后主動脈弓分叉處動脈粥樣硬化病變面積減少。此外，通過HE染色觀察高脂飲食喂養可促使ApoE-/-小鼠主動脈根部斑塊的形成，而給予漢黃芩素后主動脈根部的斑塊絕對面積與相對面積均有顯著降低(P<0.05，圖1B～D)。整主動脈的油紅染色結果顯示與HFD組比較，HFD+wogonin組ApoE-/-小鼠整主動脈的斑塊的相對面積明顯較低(P<0.05，圖1E-F)。以上結果表明，在高脂飲食喂養誘導動脈粥樣硬化的ApoE-/-小鼠模型中，漢黃芩素能有效緩解動脈粥樣硬化的發展。

圖1 給予漢黃芩素顯著緩解高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化的發展Fig.1 Administration of wogonin significantly alleviated the development of atherosclerosis in ApoE-/- mice fed with high-fat diet注：A：主動脈弓；B～D：主動脈根部組織切片的HE染色圖與定量分析，50×；E～F：整主動脈的油紅O染色與定量分析。a：正常飲食組；b：高脂飲食組；c：高脂飲食+漢黃芩素10 mg/kg組；d：高脂飲食+漢黃芩素20 mg/kg組，下同；每組n=6；與正常飲食組比較，###P < 0.001；與高脂飲食組比較，**P < 0.01，***P < 0.001。Not: A: Representative pictures of the aortic arch; B-D: Representative pictures of H&E staining of aortic root and oil red O staining area analysis of aortic root,50×.a: ND group; b: HFD group; c: HFD+wogonin 10 mg/kg group; d: HFD+wogonin 20 mg/kg group,the same below; n=6 in each group; Compared with ND group,###P < 0.001; Compared with HFD group,** P < 0.01,*** P < 0.001.

2.2 漢黃芩素不影響高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠的血脂

隨后我們探討漢黃芩素對高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠斑塊的緩解作用是否與血脂有關。在小鼠處死前收集了血清以檢測血脂水平。如表2所示，HFD組與HFD+wogonin組ApoE-/-小鼠的血脂水平(TG/TC/LDL/HDL)的差異無統計學意義，表明漢黃芩素對動脈粥樣硬化的緩解作用不是通過影響血脂水平。

表2 ApoE-/-小鼠血脂水平Table 2 Serum lipid levels in ApoE-/- mice = 12)

2.3 漢黃芩素緩解高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠的動脈炎癥

炎癥反應貫穿于動脈粥樣硬化發生與發展的整個過程中[10]。我們進一步研究漢黃芩素對高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠動脈炎癥的影響。主動脈根部的抗Moma-2免疫熒光染色實驗結果顯示，高脂飲食喂養可引起動脈粥樣硬化斑塊內單核/單核巨噬細胞的招募與浸潤，經過漢黃芩素處理后，斑塊內單核/單核巨噬細胞的浸潤顯著減少(P<0.05，圖2)。另外，RT-qPCR分析顯示，與HFD組相比，漢黃芩素處理后，炎癥因子(TNF-α和IL-6)和粘附分子(ICAM-1和VCAM-1)在動脈中的mRNA表達顯著降低(P<0.05，表3)。與此同時，抗VCAM-1免疫熒光染色實驗結果顯示高脂飲食喂養的ApoE-/-小鼠主動脈根部VCAM-1表達明顯增多，而漢黃芩素處理后，VCAM-1表達有所減少(P<0.05，圖3)。以上結果表明漢黃芩素顯著抑制高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠的動脈炎癥，且這可能與其抗動脈粥樣硬化的作用有關。

圖2 ApoE-/-小鼠的主動脈根部抗Moma-2免疫熒光染色(50×)Fig.2 Anti-Moma-2 immunofluorescence staining of aortic root in ApoE-/- mice (50×)注：每組n=6，與正常飲食組比較，###P < 0.001；與高脂飲食組比較，***P < 0.001。Note: n=6 in each group; Compared with ND group,###P < 0.001; Compared with HFD group,***P < 0.001.

表3 ApoE-/-小鼠動脈炎癥因子的mRNA水平Table 3 mRNA levels of arteries in ApoE-/- mice = 6)

圖3 ApoE-/-小鼠的主動脈根部抗VCAM-1免疫熒光染色(50×)Fig.3 Anti-VCAM-1 immunofluorescence staining of aortic root in ApoE -/- mice (50×)注：每組n=6，與正常飲食組比較，###P < 0.001；與高脂飲食組比較，**P < 0.01，***P < 0.001。Note: n=6 in each group; Compared with ND group,###P < 0.001; Compared with HFD group,**P < 0.01，***P < 0.001.

2.4 漢黃芩素抑制高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠動脈中NF-κB信號通路的激活

為進一步研究漢黃芩素的作用機制，我們檢測了炎癥信號通路NF-κB信號通路的激活。如圖4所示，與HFD組相比，漢黃芩素處理可抑制高脂飲

食喂養ApoE-/-小鼠主動脈中的NF-κB 的磷酸化和NF-κB抑制蛋白α(IκB-α)的降解(P<0.05，圖4)，表明其抗炎作用可能是通過抑制NF-κB信號通路的激活所實現的。

圖4 漢黃芩素對高脂飲食誘導的ApoE-/-小鼠動脈中NF-κB的磷酸化與IκB-α的表達的影響Fig.4 The effect of wogonin on the phosphorylation of NF-κB and expression of IκB-α in arterial tissues of ApoE-/- mice induced by high-fat diet注：每組n=6，與正常飲食組比較，###P < 0.001；與高脂飲食組比較，**P < 0.01，***P < 0.001。Note: n=6 in each group; Compared with ND group,###P < 0.001; Compared with HFD group,**P < 0.01, ***P < 0.001.

3 討論

動脈粥樣硬化是一種動脈慢性炎癥疾病，是目前世界范圍內導致心血管疾病發病和死亡的主要原因之一[1,3]。血管炎癥的持續存在被認為是動脈粥樣硬化發生發展的動力[8,9]。然而，現今對慢性低度炎癥的發生機制缺乏認識，同樣地，當前臨床治療方案也相對缺乏[15]，因此，進一步揭示炎癥相關機制對動脈粥樣硬化的治療干預具有重要意義。

迄今為止，許多因素與動脈粥樣硬化的發病有關，這些因素不僅包括血脂異常、肥胖、糖尿病、高血壓、衰老和吸煙等傳統危險因素，還包括感染和慢性炎癥等非經典危險因素[16]。單核細胞/巨噬細胞作為炎癥性動脈粥樣硬化的中樞介質發揮著重要作用[1]。當脂質積累于血管內膜后，循環單核細胞被活化的血管內皮細胞招募并遷移至內皮下層，然后分化為巨噬細胞，巨噬細胞隨后攝取氧化低密度脂蛋白等修飾脂蛋白，而富含膽固醇的巨噬細胞將形成泡沫細胞(動脈粥樣硬化發生發展的一個標志)，然后一系列復雜的炎癥級聯被觸發，從而促進動脈粥樣硬化病變的發展，最終導致斑塊破裂及其相關的心血管事件發生[17-19]。近期針對炎癥干預的臨床實驗顯示心血管風險患者的心血管結局顯著改善，進一步證明炎癥在動脈粥樣硬化性心血管疾病中的因果作用[20,21]。因此，靶向炎癥的治療方案被認為是一種有前景的治療動脈粥樣硬化的策略[18,22]。漢黃芩素是一種天然黃酮化合物，具有顯著的抗炎的作用，此研究利用高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠的動物模型研究漢黃芩素對動脈粥樣硬化的影響。研究發現漢黃芩素可有效緩解高脂飲食喂養ApoE-/-小鼠主動脈弓、根部和整主動脈中的動脈粥樣硬化斑塊的形成，提示漢黃芩素可能是一種潛在治療動脈粥樣硬化的天然藥物。而后進一步發現高脂飲食喂養可引起單核/單核巨噬細胞招募與浸潤增加，動脈炎癥因子(TNF-α和IL-6)和粘附因子(ICAM-1和VCAM-1)的mRNA水平和主動脈根部VCAM-1蛋白水平升高，而給予漢黃芩素可有效改善以上變化。NF-κB信號通路是經典的炎癥信號通路，在此研究中，高脂飲食喂養可增加NF-κB的磷酸化和IκB-α的降解，而漢黃芩素處理后NF-κB的磷酸化和IκB-α的降解明顯被抑制。這些結果表明漢黃芩素可能通過抑制NF-κB調控的炎癥反應緩解動脈粥樣硬化的發展。

綜上，漢黃芩素抗動脈粥樣硬化的作用可能依賴于其對NF-κB調控的炎癥反應的抑制活性，并且漢黃芩素可能是治療動脈粥樣硬化的有效單體。