維生素C對克氏原螯蝦生長及非特異性免疫機能的影響

田立立，萬金娟，孟祥龍，周梓涵，孫龍生*，唐建清

（1.揚州大學動物科學與技術(shù)學院，江蘇 揚州 225009；2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

“十三五”以來，小龍蝦（學名克氏原螯蝦，Procambarus clarkii）產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)爆發(fā)式增長，2019年我國小龍蝦養(yǎng)殖規(guī)模達128.66萬hm2，總產(chǎn)量達208.96萬t，總產(chǎn)值突破4 000億元大關(guān)[1]。其中稻蝦綜合種養(yǎng)占86%，已經(jīng)成為小龍蝦生態(tài)健康養(yǎng)殖的主流模式。在實際生產(chǎn)過程中，小龍蝦養(yǎng)殖密度大，水體殘餌糞便累積較多，水質(zhì)難以控制，尤其是小龍蝦池塘水草豐富，水體晝夜pH值變化大，再加上不穩(wěn)定的氣候條件以及相互蠶食的習性等因素，小龍蝦機體長期處于應(yīng)激狀態(tài)，導致疾病頻發(fā)，生長緩慢，甚至出現(xiàn)大規(guī)模死亡現(xiàn)象，嚴重制約產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]。通過營養(yǎng)調(diào)控來促進克氏原螯蝦生長，提高抗病力、免疫力已成為研究熱點。文獻［3］研究表明，維生素C（Vc）具有促進克氏原螯蝦幼蝦生長，提升機體免疫力和成活率的作用。Fuertes等[4]認為，飼料中不同Vc水平（0、0.2、0.4和0.8 g/kg）對克氏原螯蝦存活率沒有顯著影響，但0.2 g/kg組的克氏原螯蝦機體生長最為顯著，且餌料系數(shù)明顯降低。有關(guān)克氏原螯蝦對Vc的適宜需要量以及Vc影響蝦的成活與生長的生理機制尚未清楚。該試驗旨在探討飼料中添加不同水平Vc對克氏原螯蝦幼蝦生長及免疫機能的影響，為進一步明確克氏原螯蝦對Vc的適宜需要量提供依據(jù)。

1 研究方法

1.1 試驗設(shè)計

采用單因子試驗設(shè)計，選擇規(guī)格基本一致、活力好、附肢健全、初始體質(zhì)量為（3.19±0.06）g的克氏原螯蝦幼蝦540尾，隨機分為6組，每組3個重復，放入18個循環(huán)流水水泥池中養(yǎng)殖（2 m×2 m×0.8 m），每個水泥池放養(yǎng)30尾，同時配套遮陽與隱蔽設(shè)施。

1.2 試驗飼料

以魚粉、豆粕為蛋白源，豆油為脂肪源，并補充礦物質(zhì)、維生素等，在此基礎(chǔ)上添加不同水平的維生素C，配制6組等氮等能飼料，見表1。飼料中維生素C（95%包膜維生素C，羅氏公司）的添加量為：0、30、60、120、240和480 mg/kg。試驗飼料委托安徽新希望飼料有限公司加工制作，每組飼料2 t/批次，選取中間部分的飼料，50℃烘干后置于-20℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平①（風干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理

克氏原螯蝦幼蝦在水泥池暫養(yǎng)14 d后正式開始投喂試驗飼料，每天投喂2次（07：30—08：30和18：30—19：30）。初始日投餌量為蝦體質(zhì)量的3%，后期根據(jù)攝食和生長情況適當調(diào)整，以投餌后1 h內(nèi)吃完為宜。飼養(yǎng)期間水溫21.9～27.5℃，pH值7.8～8.5，ρ（溶解氧）>6 mg/L，ρ（氨氮）<0.04 mg/L，ρ（硫化氫）<0.01 mg/L，ρ（亞硝酸鹽）<0.01 mg/L，試驗期間07：30—18：30打開遮陽網(wǎng)，每日觀察蝦攝食及死亡情況，發(fā)現(xiàn)死蝦及時撈出并稱重計數(shù)，分析死亡原因。試驗期60 d。

1.4 樣品采集

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，禁食24 h，對各水泥池的克氏原螯蝦分別進行計數(shù)和稱重，以計算存活率和增重率。冰浴麻醉后進行蝦體的解剖，每個水泥池隨機選取3尾蝦（每組9尾蝦），先抽血淋巴，然后采集肌肉、肝胰腺并稱重。另隨機采集3尾蝦的肝胰腺，液氮速凍后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫郎y定免疫相關(guān)指標。

1.5 指標測定

（1）生長指標。分別按下式計算增重率（WGR）、成活率（SR）、肥滿度（CF）、含肉率（MF）、肝胰腺指數(shù)（HSI）、飼料系數(shù)（FCR）、特定生長率（SGR）等指標。

增重率（%）=（M1×M0）/M0×100%

成活率（%）=N1/N0×100%

飼料系數(shù)=Mf（/M1×M0）

特定生長率（%/d）=（ln M1×ln M0）（/T1-T0）×100%

含肉率（%）=Mj/M1×100%

肥滿度=M1/Lt3×100%

肝胰腺指數(shù)=Mg/M1×100%

式中：M1，M0——分別為終末平均質(zhì)量、初始平均質(zhì)量，g；

Mf——飼料攝入量，g；

Mj、Mg——分別為肌肉重、肝胰腺重，g；

N1、N0——分別為終末尾數(shù)、初始尾數(shù)，尾；

L1——終末均體長，cm；

T1、T0——試驗開始時間、結(jié)束時間，d。

（2）血液免疫指標。用1 mL無菌注射器（含抗凝劑）從螯蝦頭胸甲腹側(cè)取血淋巴，注入無菌1.5 mL離心管中，使血液與抗凝劑最終比例為1∶1，低溫離心（4℃，3 000 r/min）10 min（分離血漿和血細胞），取上清液，-20℃保存?zhèn)溆茫糜谘好庖咧笜耍ㄈ芫浮A性磷酸酶、酸性磷酸酶）的測定。

（3）肝胰腺抗氧化相關(guān)指標。將采集的肝胰腺用生理鹽水沖洗干凈，然后按1∶9質(zhì)量體積比加入生理鹽水，冰浴勻漿，以3 500 r/min離心10 min，取上清液置于新的離心管待測。所有上清液先用考馬斯亮藍法檢測其蛋白濃度后再測其他抗氧化指標。肝胰腺超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.6 統(tǒng)計分析

采用Excel 2010和SPSS 20.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析（One Way ANOVA），多重比較采用Duncan法，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差（Mean±Std）表示，統(tǒng)計學意義水平設(shè)定為P<0.05，表中同行數(shù)據(jù)肩標字母不同，表示組間差異具統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中維生素C添加水平對克氏原螯蝦生長的影響

維生素C添加水平對克氏原螯蝦生長的影響見表2。由表2可見，120 mg/kg Vc試驗組蝦的增重率和特定生長率顯著高于其他各組（P<0.05）；480 mg/kg Vc組蝦的含肉率顯著高于其他各組（P<0.05）；各組間克氏原螯蝦其余生長指標未出現(xiàn)統(tǒng)計學意義差異（P<0.05）。

表2 維生素C添加水平對克氏原螯蝦生長的影響

2.2 飼料中維生素C添加水平對克氏原螯蝦血液免疫相關(guān)指標的影響

維生素C添加水平對克氏原螯蝦血液免疫指標的影響見表3。由表3可見，120 mg/kg Vc試驗組血清溶菌酶顯著高于其他各組（P<0.05），而其他試驗組間則沒有統(tǒng)計學意義差異（P>0.05）；120和480 mg/kg Vc試驗組血清酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性沒有統(tǒng)計學意義差異（P>0.05），卻顯著高于其他4組（P<0.05）。

表3 維生素C添加水平對克氏原螯蝦血液免疫指標的影響

2.3 維生素C添加水平對克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化能力的影響

維生素C添加水平對克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化能力的影響見表4。由表4可見，120 mg/kg Vc組蝦的肝胰腺過氧化氫酶活性顯著高于其他各組（P<0.05），其他試驗組間則沒有統(tǒng)計學意義差異（P>0.05）；飼料中維生素C添加量對克氏原螯蝦肝胰腺超氧化物歧化酶活性沒有顯著影響（P>0.05）；飼料中未添加維生素C組肝胰腺MDA含量顯著高于各添加組（P<0.05）；120 mg/kg Vc試驗組MDA含量顯著低于其他組（P<0.05）。

表4 維生素C添加水平對克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化能力的影響

3 討論

3.1 維生素C添加量對克氏原螯蝦生長的影響

維生素C作為一種水溶性維生素具有重要營養(yǎng)作用。邵光明等[5]報道，飼料中添加0.02%維生素C可顯著提高克氏原螯蝦的增重率，促進生長。甲殼動物體表硬化層由一種外殼蛋白和苯醌經(jīng)交聯(lián)作用而成，維生素C可通過影響苯醌的形成起到促進蝦蟹蛻殼的作用，由此促進蝦蟹的生長[6]。該試驗中，維生素C對克氏原螯蝦的存活率和飼料利用狀況并無顯著影響，但隨著飼料中維生素C水平的提高，增重率和特定生長率呈先上升而后下降的趨勢。侯迎梅等[7]在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）幼蟹上也得出了類似的結(jié)論。由此表明，飼料中添加適量的維生素C（120 mg/kg）對克氏原螯蝦具有顯著的促生長作用，但是維生素C過量時增重率和特定生長率反而下降，可能過量的維生素C產(chǎn)生毒害作用抑制機體生長。左迪[8]對紅螯光殼螯蝦（Cherax quadricarinatus）的研究結(jié)果表明，飼料中維生素C的添加量為0～400 mg/kg時，蝦的增重率和特定生長率顯著上升。不同研究結(jié)果存在差異的原因可能與研究的物種、維生素C添加形式不同有關(guān)。

目前，關(guān)于維生素C對水產(chǎn)動物含肉率影響的研究鮮有報道，含肉率是評價魚蝦生產(chǎn)性能及經(jīng)濟價值的重要指標[9]。在該試驗中，當飼料中維生素C添加量為480 mg/kg時克氏原螯蝦的含肉率顯著提高，這表明一定量的維生素C可促進克氏原螯蝦肌肉的生長。本試驗中克氏原螯蝦含肉率最高為480 mg/kg Vc組（15.36±1.10）%，遠低于洞庭湖中的20.21%[10]以及貴州湄潭稻田養(yǎng)殖的18.40%[11]，但高于水族箱養(yǎng)殖的12.83%[12]。造成差異的原因可能與初始規(guī)格、發(fā)育階段、養(yǎng)殖模式、自然環(huán)境、水質(zhì)條件、飼料組成等的差異有關(guān)[13]。

3.2 維生素C添加量對克氏原螯蝦血漿免疫機能的影響

甲殼動物的免疫防御系統(tǒng)屬于非特異性免疫系統(tǒng)，除了SOD等抗氧化指標外，堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和溶菌酶等也是重要的非特異性免疫指標，被廣泛地用來評價蝦類的健康狀況、營養(yǎng)狀況以及對環(huán)境的適應(yīng)性[14]。

作為非特異性免疫生物防御因子，溶菌酶具有溶菌活性，并可以誘導其他免疫因子的合成和分泌[15-16]。ACP和AKP是蝦蟹重要的非特異性磷酸水解酶[17]，直接參與磷酸基團的代謝和物質(zhì)的攝取轉(zhuǎn)運，可形成水解酶體系消除病原異物，與機體的生長存活息息相關(guān)。在血細胞進行吞噬和包囊反應(yīng)中會伴有ACP的釋放，參與病毒或細菌的識別、吞噬、降解[18]。

在該試驗中，當飼料維生素C添加量為0～240 mg/kg時，克氏原螯蝦血漿AKP、ACP與LZM活性隨著飼料中維生素C添加水平的提高先上升后下降，這表明飼料中適量的維生素C能夠影響克氏原螯蝦的免疫防御機制，提高機體免疫活性和抗病力，而過量的維生素C導致一定的抑制作用，抵消部分免疫增強效用。隨著維生素C含量的進一步增加，血漿AKP、ACP活性升高，這可能是機體的一種免疫補償機制。這與侯迎梅等[7]在三疣梭子蟹幼蟹上的研究結(jié)果不一致，可能與試驗對象的品種、養(yǎng)殖模式、生長階段等不同有關(guān)，具體原因及作用機制還有待進一步研究。

3.3 維生素C添加量對克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化能力的影響

抗氧化酶是由活細胞產(chǎn)生的幾種生物催化劑，是抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分，能夠起到減緩氧化速度的作用，可將過氧化物轉(zhuǎn)換為毒害較低或無害的物質(zhì)，保護生物免受氧化損害[19]。SOD與CAT廣泛分布在生物體內(nèi)，可對產(chǎn)生的ROS進行解毒，將H2O2分解為H2O和O2以避免細胞損傷和病變[20-21]，維持生物體的正常代謝和體內(nèi)環(huán)境動態(tài)平衡。MDA是膜脂質(zhì)過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量能夠反映出機體氧化損傷程度和清除自由基的能力[22]。因此，檢測蝦蟹組織中的SOD、CAT的活性和MDA含量的變化可以較為準確地反映機體的抗氧化狀況。該試驗結(jié)果顯示，克氏原螯蝦肝胰腺CAT活性以飼料中維生素C含量120 mg/kg為拐點呈先升高后降低的變化趨勢，而肝胰腺MDA含量則隨著飼料中維生素C含量增加而呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢，這說明飼料中適量的維生素C可有效提高克氏原螯蝦抗氧化酶活性和降低脂質(zhì)過氧化物MDA對機體的損害，從而增強機體的抗氧化功能，但進一步增加維生素C含量則會損傷機體抗氧化系統(tǒng)。在該試驗中，不同維生素C添加量對克氏原螯蝦肝胰腺SOD活性沒有顯著影響，與周歧存等[23]對凡納濱對蝦（Prawns vannamei）的研究結(jié)果一致，可能是由于動物體內(nèi)的兩大抗氧化體系協(xié)同作用，在機體內(nèi)發(fā)揮自由基清除作用。

4 結(jié)論

對克氏原螯蝦的適宜維生素C添加量為120 mg/kg，可顯著促進克氏原螯蝦的生長，提高血漿LZM、AKP及ACP活性，同時提高克氏原螯蝦肝胰腺的抗氧化性能，降低MDA含量。若維生素C添加量繼續(xù)增加，則會導致克氏原螯蝦增重率及特定生長率下降，降低免疫酶活力，這可能與維生素C過量使用導致的抑制作用有關(guān)。