Y-STR基因座在鑒別Ⅰ期臨床試驗混淆生物樣本中的應用初探

曾麗艷 王 倩 柯 晶 董華娟 孟現民

（上海市（復旦大學附屬）公共衛生臨床中心 上海 201500）

Ⅰ期臨床試驗是藥物有效性和安全性評價的重要環節，采集自受試者的生物樣本是后續檢測分析的基礎，因生物樣本是有限而寶貴的樣本資源，所以對生物樣本進行有效管理是臨床試驗質量控制的重要環節［1-2］。然而在生物樣本采集的過程中，難免出現標識信息不清楚或者標簽脫落的情況，時常因無法識別生物樣本的個體來源而將其銷毀處理，這不僅造成了資源的浪費，而且試驗數據的缺失在一定程度上導致了臨床試驗結果的偏倚［3-5］。我院開展的一項Ⅰ期臨床試驗中，研究護師在采集10號和22號受試者血液樣本時（10號受試者為女性，22號受試者為男性），因采血管負壓出現問題而緊急更換了兩支空白標簽的備用采血管，導致血液樣本送到實驗室后，實驗室工作人員無法判定這兩個樣本來自哪個個體。研究報道Y染色體短串聯重復序列（Y-chromosomal short tandem repeat，YSTR）是位于男性Y染色體上的人類多態性短串聯重復序列（short tandem repeats，STR）位點，一般情況下，只有男性個體才有Y染色體，因此，Y-STR具有男性遺傳、男性特異性的特點，Y-STR可作為性別鑒定的依據，在標準常染色體DNA譜分析不能提供信息的情況下常被法醫用于DNA分析［6］，如在調查性侵案件的司法取證和父系譜系分化中非常有用［7］。但是，至今國內外未有將Y-STR檢測運用于Ⅰ期臨床試驗的研究報導。為了保證臨床試驗數據的完整性，本文首次創新性地將Y-STR檢測方法運用于Ⅰ期臨床試驗中，以探討該方法在Ⅰ期臨床試驗生物樣本來源識別中的應用。

資料和方法

樣本來源某生物等效性實驗空腹試驗部分第一周期第13個采血點因標簽標識不清而無法辨別的10號和22號受試者全血樣本（6 mL EDTA抗凝采血管）2管，實驗時分別編號為：A和B。已知男性全血樣本1管，作為陽性對照，編號為P。已知女性全血樣本1管，作為陰性對照，編號為N。

儀器與試劑血基因組DNA小量試劑盒和D15000 Marker（美國Axygen公司），Trans2K Plus DNA Marker（北京全式金生物技術有限公司），瓊脂糖和6×加樣緩沖液（美國Genview公司），2×PCR buffer Mix、Ex Taq HS和dd H2O（日 本TaKaRa公司），電泳儀（美國Bio-Rad公司），低溫離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），PCR擴增儀（德國Eppendorf公司），紫外凝膠成像儀（北京天根生化科技有限公司）。引物合成由美國Invitrogen公司完成。

DNA抽提將P、N、A和B 4支采血管放于低溫離心機中，4℃、1 200×g離心10 min，分別分離血漿和血細胞沉淀，留作備用，離心操作在采血后2 h內完成。按照血基因組DNA小量試劑盒說明書分別提取200μL血漿和200μL血細胞沉淀中的DNA。

基因座選擇和引物設計根據Y-STR基因座DYS460［8］的序列特征，設定所選目標基因座的片段大小，用Primer 5.0軟件分別設計正反引物序列（表1）。DYS513［9］和DYS570［10］的 引 物 序 列 來 源 于 參考文獻（表1）。

表1 DYS460、DYS513和DYS570的正反引物序列和產物片段大小Tab 1 The sequence of the forward and reverse primers and product fragment sizesof DYS460，DYS513 and DYS570

PCR擴增基因片段將引物稀釋成濃度10 mol/L，每對正反引物各取10μL混合，形成PCR引物混合液。DNA模板分別吸取A和B的血漿和血細胞樣本中提取的DNA。制備25μL的PCR反應液為：12.5μL 2×PCR buffer Mix、2μL Ex Taq HS、6μL dd H2O、2μL PCR引物混合液和2.5μL DNA模板，將PCR反應液放于PCR擴增儀中擴增（反應條件見表2）。

表2 體外擴增Y-STR基因座片段（DYS460、DYS 513和DYS 570）的反應條件Tab 2 The reaction conditions of Y-STR locus（DYS460，DYS 513 and DYS 570）amplified in vitro

DNA檢測各取5μL DNA模板，加入1μL 6×加樣緩沖液混勻。制備1%瓊脂糖凝膠，將混合液加入凝膠孔中，D15000 Marker作為參照，于120 V電壓下電泳15 min。電泳結束后，于紫外凝膠成像儀中拍照觀察。

PCR產物檢測各取5μL PCR產物模板，加入1μL 6×加樣緩沖液混勻。制備2%瓊脂糖凝膠，將混合液加入凝膠孔中，Trans2K Plus DNA Marker作為參照，于120 V電壓下電泳20 min。電泳結束后，于紫外凝膠成像儀中拍照觀察。

結 果

P、N、A和B的血細胞中均抽提到DNAP和N樣本的血細胞DNA、A和B樣本的血漿和血細胞DNA分別用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，結果如圖1所示。A和B血漿DNA樣本均無主條帶，而P、N、A和B血細胞樣本有清晰的DNA主條帶，表明A和B的血漿中DNA含量可能非常少而無法用瓊脂糖凝膠電泳分離出，而P、N、A和B的血細胞中均成功抽提到了DNA。

圖1 血細胞和血漿的DNA電泳結果Fig 1 DNA electrophoresis results of blood cells and plasma

圖2 體外擴增DYS460、DYS513和DYS570基因座的電泳結果Fig 2 Electrophoresisresults of in vitro amplification of DYS460，DYS513 and DYS570 loci

A樣本的血細胞DNA均擴增出3個Y-STR基因座P和N樣本的血細胞DNA、A和B樣本的血漿和血細胞DNA均分別用3個Y-STR基因座（DYS460、DYS513和DYS570）的引物進行擴增，產物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離。結果如圖2所示，作為陰性對照的N樣本血細胞DNA以及B樣本的血細胞DNA和血漿DNA都無法擴增出YSTR基因座條帶，而作為陽性對照的P樣本血細胞DNA以及A的血細胞DNA樣本中均擴增出3個YSTR基因座，且產物條帶大小與理論值（表1）相符，說明A樣本為20號男性受試者的樣本，B樣本為10號女性受試者的樣本。因A樣本的血漿幾乎不含Y染色體DNA，因此也無法擴增出產物。

討 論

Ⅰ期臨床試驗常涉及密集采血，血液采集數量多、時間短、要求高，涉及環節也比較多，加上操作人員的熟練程度、受試者的靜脈條件、采血管壓力等原因，會出現臨床樣本標識不清、標簽脫落等情況，導致無法辨別樣本來自哪個個體。

自2015年7月原國家食品藥品監督管理總局發布《關于開展藥物臨床試驗數據自查核查工作的公告（2015年第117號）》以后，藥物臨床試驗數據完整性問題越來越受到重視，臨床試驗質量的控制措施進一步被細化［11-12］。因此，建立鑒定混淆生物樣本的應急管理措施，能夠為后續生物樣本的檢測和數據的完整性提供樣本基礎，從而保障臨床試驗的質量。

本文以血細胞DNA為模板，選取Y染色體的3個基因座（DYS460、DYS513和DYS570），成功鑒別出2個不同性別受試者的血液樣本。針對不同性別受試者的血液樣本混淆的情況，此方法可以作為生物樣本質量控制中的一種應急措施，建議將其納入生物樣本質量控制的標準操作程序中。然而，本文探討的案例限于兩位異性受試者樣本的鑒別，至于多位男性受試者的樣本的鑒別方法，因Y-STR的基因多樣性和單倍型多樣性［13-14］，以及Y-STR基因座存在突變的可能［15-16］，建議可以利用個人前后采血點的樣本進行Y-STR的檢測和比對分析，但是其中涉及的相關倫理問題還需要進一步研究決定。為了盡可能避免樣本標識數據缺失的情況，除了在樣本采集前對物品進行充分準備外，也應對研究護師加強培訓，如可以配備一名機動護師在旁邊，幫助采血護師及時補上樣本標識信息。此外，本文提倡的應急措施還需進一步建立統一的操作標準，有待在后續研究中進行完善。

作者貢獻聲明曾麗艷 論文構思，實驗執行，數據采集，統計分析，論文撰寫和修訂。王倩 數據分析、論文撰寫和修訂。柯晶 文獻調研和整理。董華娟 論文修訂。孟現民 研究指導，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。