基于蛋白質(zhì)組學(xué)研究NCAM 1在運(yùn)動誘發(fā)的肺動脈高壓及特發(fā)性肺動脈高壓中的差異表達(dá)

何楊柯 易 鑫 李卓霖 黃 瑋

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科 重慶 400016）

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是死亡率高、診斷時(shí)間晚且無法徹底治愈的惡性病。在我國，未經(jīng)治療的PAH患者5年生存率僅為21%［1］。PAH早期癥狀隱匿，經(jīng)常被誤診和漏診，患者從出現(xiàn)癥狀到確診，平均需要27個(gè)月，對于無典型危險(xiǎn)因素的特發(fā)性肺動脈高壓（idiopathic PAH，IPAH）患者，診斷時(shí)間可長達(dá)47個(gè)月［2］。臨床上，超過75%的PAH患者確診時(shí)WHO心功能為Ⅲ或Ⅳ級［3］。早期診斷并得到有效治療的PAH患者遠(yuǎn)期生存率遠(yuǎn)高于中晚期診斷的PAH患者，因此早期診斷對改善PAH患者的預(yù)后至關(guān)重要。目前臨床常用的PAH篩查方法，如超聲心動圖、心電圖、MRI、B型鈉尿肽、肌鈣蛋白等，均不能提示早期改變。無創(chuàng)的心肺運(yùn)動試驗(yàn)（cardiopulmonary exercise testing，CPET）會發(fā)現(xiàn)PAH患者早期運(yùn)動耐量下降，但不能早期診斷PAH。侵入性心肺運(yùn)動試 驗(yàn)（invasive cardiopulmonary exercise testing，iCPET）是美國哈佛醫(yī)學(xué)院率先開展的新技術(shù)，可診斷運(yùn)動誘發(fā)的PAH（exercise induced PAH，EiPAH）。與非侵入性CPET不同的是，iCPET運(yùn)動前需要置入肺動脈導(dǎo)管和橈動脈導(dǎo)管，這一關(guān)鍵區(qū)別可提供休息和運(yùn)動時(shí)完整的心肺血流動力學(xué)和外周組織血?dú)夥治龅南嚓P(guān)數(shù)據(jù)。如果患者有不明原因的呼吸困難（排除心力衰竭、PAH及原發(fā)性肺病），靜息狀態(tài)下右心導(dǎo)管檢查平均肺動脈壓力（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）<25 mmHg（1 mmHg=0.133 k Pa，下同），各項(xiàng)檢測值均正常，即可行iCPET檢查，通過運(yùn)動時(shí)mPAPmax≥30 mmHg且肺血管阻力（pulmonary vascular resistance，PVR）PVRmax≥120 dyne·s·cm-5，即 可診斷為EiPAH，其可能是PAH早期階段。

本研究旨在通過蛋白質(zhì)組學(xué)液相質(zhì)譜等技術(shù)，觀察在EiPAH、IPAH患者血漿中人神經(jīng)細(xì)胞黏附分子1（human neural cell adhesion molecule 1，NCAM 1）的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，為進(jìn)一步揭示其與疾病的關(guān)系以及研究PAH早期生物標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

資料和方法

患者資料及分組經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，根據(jù)入組診斷標(biāo)準(zhǔn)，回顧性分析2016年1月至2018年11月我院心血管內(nèi)科收治的14例EiPAH及IPAH患者。IPAH診斷標(biāo)準(zhǔn)：2015年歐洲心臟病學(xué)會/歐洲呼吸學(xué)會《肺動脈高壓診斷和治療指南》［4］，由我院心血管內(nèi)科導(dǎo)管室行右心導(dǎo)管術(shù)后確診。EiPAH診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)美國哈佛醫(yī)學(xué)院附屬Brigham and Women’s Hospital肺血管中心主任Waxman等［5］制定的iCPET診斷標(biāo)準(zhǔn)，由我院心血管內(nèi)科導(dǎo)管室iCPET中心行iCPET后確診。排除以下影響NCAM 1血漿濃度的疾病：冠心病［6］，癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)病變［7］，其他惡性腫瘤疾病。對照組：2018年10月在我院體檢合格或行右心導(dǎo)管及iCPET檢查排除心血管內(nèi)科相關(guān)疾病，排除心、腦、肝、腎、內(nèi)分泌腺等重要臟器疾患，肝腎功能試驗(yàn)正常，家族中無心血管內(nèi)科相關(guān)疾病病史，與實(shí)驗(yàn)組和疾病對照組在性別、年齡、體重方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。擴(kuò)大樣本檢驗(yàn)中納入標(biāo)準(zhǔn)未變。

試劑與儀器試劑：ELISA試劑盒購自美國Thermo Scientific公司，小樣品研磨試劑盒、IPG 13 cm（p H 3-10 NL）非線性膠帶、DIGE染料（Cy2TM，Cy3TM，Cy5TM）、EDTA抗凝管購自美國GE Healthcare公司。無水乙醇、乙酸等常用試劑均為國產(chǎn)分析純。儀器：電泳儀（SE-600全套電泳設(shè)備，瑞典Amersham公司），Ty-phoon掃描儀和De圖譜分析軟件（美國GE healthcare公司），光密度掃描儀（型號：GS-710，美國Bio-Rad公司）；質(zhì)譜平臺（型號：Thermo Q ExactiveTMHF-X）和色譜平臺（型號：Easy nanoLC 1200）（美國Thermo Scientific公司）；Bioworks軟件（美國Ginkgo Bioworks公司）。

標(biāo)本采集對符合納入標(biāo)準(zhǔn)的對照組及患者（行右心導(dǎo)管前），使用EDTA抗凝管采集靜脈血2 mL，上下顛倒混勻10次，于4℃、1 600×g離心10 min。用移液器將上層血漿轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，添加蛋白酶抑制劑混勻，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

去除白蛋白的血漿樣品制備及處理血樣品解凍后，各取1 mL樣品，于4℃、12 000×g離心1 min，吸取中間層，除去上層油脂。稀釋后用0.22μm濾膜過濾，用高豐度蛋白分離柱（美國Agilent公司）處理去除高豐度蛋白質(zhì)。使用Bradford法對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，并進(jìn)行Cy2、Cy3、Cy5標(biāo)記。將標(biāo)記樣品加入同一EP管中，震蕩混勻，點(diǎn)動離心。同時(shí)設(shè)置內(nèi)標(biāo)，加入等體積的2×樣品緩沖液，冰浴10 min。進(jìn)行IEF與SDS-PAGE。電泳結(jié)束后采用硝酸銀染色方法染色。

掃描及凝膠圖像分析使用Typhoon掃描儀和eCyderTM v6.5軟件（美國GE Healthcare公司）進(jìn)行掃描，獲取圖像進(jìn)行分析。1張膠片經(jīng)過掃描后得到3張膠圖，對膠圖上每個(gè)蛋白點(diǎn)掃描進(jìn)行膠內(nèi)分析（differential in-gel analysis，BVA），匹配后再對各個(gè)蛋白點(diǎn)的相對量進(jìn)行比較（Cy3/Cy2或Cy5/Cy2）以確定差異蛋白質(zhì)，組間差異蛋白質(zhì)采用t檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行定量比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

質(zhì)譜鑒定對差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行酶解、MALDI質(zhì)譜分析，并用BIOWORKS軟件搜索ipi HUMAN v3.53蛋白質(zhì)庫，鑒定差異蛋白質(zhì)。

ELISA檢測樣本擴(kuò)增后，運(yùn)用ELISA方法檢測各組血漿中NCAM 1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，ELISA按試劑盒（美國Thermo Scientific公司）說明書執(zhí)行。

結(jié) 果

各組患者臨床資料的比較該研究招募的患者及健康對照組的基線統(tǒng)計(jì)如表1所示。與EiPAH組比較，IPAH組靜息時(shí)常規(guī)右心導(dǎo)管測得值肺動脈收縮壓［（45.63±9.01）mmHg］和血管阻力［（805±394）dyn·s·cm-5］均遠(yuǎn)高于EiPAH組（P<0.05）。IPAH組與EiPAH組相比，血尿酸、肌酐、總膽紅素水平更高，腎小球?yàn)V過率（glomerular filtration rate，eGFR）更低。兩組患者的血尿酸與靜息時(shí)mPAP、肺血管阻力呈正相關(guān)，而與心率、體循環(huán)血壓和肺毛細(xì)血管楔嵌壓無相關(guān)性（表2）。

蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜結(jié)果分析凝膠圖像發(fā)現(xiàn)，IPAH組與對照組共有119種差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中66種表達(dá)上調(diào)，53種表達(dá)下調(diào)；EiPAH組與對照組相比，共有115種差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中44種表達(dá)上調(diào)，71種表達(dá)下調(diào)。與對照組相比，兩實(shí)驗(yàn)組NCAM 1均上調(diào)。IPAH組和EiPAH組的NCAM 1相對定量值分別為19 997.4±5 471.1和21 538.4±5 938.4，相比于對照組的4 991.4±1 046.4，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001，P=0.003），兩組NCAM 1的差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）分別為4.01和4.32。

ELISA驗(yàn)證血漿中NCAM 1蛋白質(zhì)水平采用ELISA法檢測各組血漿中NCAM 1蛋白質(zhì)水平。與對照組［（2 188.03±207.995）pg/mL］相比，IPAH組和EiPAH組血漿中NCAM1蛋白質(zhì)水平明顯增高，分別 為 （2 704.667±380.402）pg/mL（P=0.002）和（2 864.222±288.602）pg/mL（P=0.001）。檢測結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致，EiPAH組增高更明顯，EiPAH組與IPAH組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004）。

受試者工作特征曲線從受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線數(shù)據(jù)可知（圖1），IPAH組與EiPAH組NCAM 1的AUCROC分別為0.93和0.98，表明該指標(biāo)能較好地預(yù)測疾病。然而，對NCAM 1與兩組患者的血流動力學(xué)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，包括靜息時(shí)和運(yùn)動高峰時(shí)的肺動脈平均壓、肺血管阻力、肺毛細(xì)血管嵌頓壓、心排量等指標(biāo)，未獲得有意義的結(jié)論。

表1 IPAH組、EiPAH組和對照組的臨床資料比較Tab 1 Comparison of clinical characters between IPAN group，EiPAH group and control group （±s）

表1 IPAH組、EiPAH組和對照組的臨床資料比較Tab 1 Comparison of clinical characters between IPAN group，EiPAH group and control group （±s）

a IPAH group vs.Control group；b EiPAH group vs.Control group；c IPAH group vs.EiPAH group.FC：Fold change.

Clinical charactersIPAH groupEiPAH groupControl groupP aP bP c（n=8） （n=6） （n=9）Age（y）36±644±1229±80.3870.0200.066 Female（%）5050600.8320.8470.988 BMI（kg/m2）23±223±121±20.1240.0510.522 WHO FCⅠ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ0/1/5/20/4/2/0---- Transverse diameter of right atrium（mm）44±934±4---0.012 Right ventricular end-diastolic diameter（mm）29±1020±2---0.002 NT-proBNP（pg/mL）731±83132±19---<0.001 Bilirubin（μmol/L）20±179±3---0.112 Creatinine（μmol/L）76±2867±12---0.441 Uric acid（μmol/L）447±138295±72---0.003 eGFR（mL·min-1·1.73m-2）98±24111±15---0.364 Mean pulmonary artery pressure（mmHg）46±917±4---<0.001 Mean pulmonary pressure during exercise（mmHg）-33±1---- Pulmonary vascular resistance（dyn·s·cm-5）805±394104±15---<0.001 Pulmonary vascular resistance during exercise（dyn·s·cm-5）-243±44----

表2 IPAH組和EiPAH組的血尿酸水平與平均肺動脈壓，肺血管阻力的相關(guān)性Tab 2 Correlation between blood uric acid levels and mean pulmonary arterial pressure and pulmonary vascular resistance in IPAH group and EiPAH group

討 論

我們與美國哈佛醫(yī)學(xué)院附屬Brigham and Women’s Hospital肺血管中心主任Aaron B.Waxman教授合作，于2017年5月在中國開展第1例iCPET診斷EiPAH［8］，同時(shí)建立了EiPAH的生物樣本數(shù)據(jù)庫和隨訪隊(duì)列，并在全國推廣這項(xiàng)新技術(shù)，協(xié)助廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院于2018年4月開展此項(xiàng)新技術(shù)。2017年，我們報(bào)道了iCPET診斷EiPAH、早期舒張性心力衰竭等疑難呼吸困難的價(jià)值［9］。2018年，我們在國際上首次報(bào)道舒張性心力衰竭合并早期肺動脈功能障礙的患者再住院率明顯增加［10］。然而，iCPET為侵入性檢查，操作復(fù)雜，系統(tǒng)配置較昂貴，檢查費(fèi)用高，尚不能在全國范圍廣泛開展。因此，研究早期診斷PAH的血漿生物標(biāo)志物是目前臨床急需解決的問題。

圖1 IPAH及EiPAH患者血漿中NCAM 1蛋白的ROC曲線Fig 1 ROC curves for NCAM 1 in the plasma of patientswith IPAH and EiPAH

本研究結(jié)果表明，NCAM 1血漿蛋白質(zhì)表達(dá)水平在IPAH和EiPAH患者中明顯升高。NCAM 1是免疫球蛋白超家族分子，也是細(xì)胞黏附分子的一員，主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞功能，在神經(jīng)細(xì)胞遷移中起關(guān)鍵作用。人NCAM 1基因定位于11q22～23，是一種膜蛋白，既往關(guān)于該蛋白的研究均基于神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病。近年來的更多研究表明，該蛋白可能是重要的信號受體，參與影響細(xì)胞黏附、遷移、增殖、凋亡、分化，并進(jìn)一步影響細(xì)胞存活及其他功能。該分子在缺血性心肌病的心肌細(xì)胞、急性心肌梗死的心肌細(xì)胞、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者的血漿中都報(bào)道過不同程度的升高，但機(jī)制尚不明確［6］。目前，尚無文獻(xiàn)報(bào)道NCAM 1與肺血管相關(guān)疾病有相關(guān)性。同時(shí)，本研究結(jié)果表明IPAH患者血尿酸、肌酐、膽紅素水平增高，且血尿酸水平與mPAP、肺血管阻力呈正相關(guān)，此結(jié)果與van Albada等［11］報(bào)道相似。該結(jié)果可能與IPAH患者的心輸出量下降、通氣血流比例失調(diào)、機(jī)體組織缺血缺氧、腎血流灌注下降所導(dǎo)致的尿酸產(chǎn)量增多而排泄減少有關(guān)。由于尿酸檢測方法簡單、費(fèi)用低廉且非侵入性，可反復(fù)測量，本研究提示尿酸可能成為臨床上反映IPAH疾病嚴(yán)重程度的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

IPAH及EiPAH與PAH相關(guān)性的具體機(jī)制尚不明確，但平滑肌細(xì)胞的過度增殖和凋亡抵抗導(dǎo)致的肺血管重構(gòu)被認(rèn)為是IPAH的重要病理生理過程。已有研究表明，Wnt3a/β-catenin/survivin信號通路可能參與PAH發(fā)生發(fā)展，而該通路已被證實(shí)參與多種腫瘤細(xì)胞的凋亡抵抗、過度增殖的調(diào)控［12］。故有學(xué)者提出，IPAH與惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制或有共同點(diǎn)。近年來，在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞黏附分子的含量異常升高。研究表明，NCAM 1可使乳腺癌腫瘤細(xì)胞凋亡減少，并促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動，該作用機(jī)制可能激活了β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附減弱，因此更具侵襲性［13］。Gavert等［14］通過研究神經(jīng)細(xì)胞黏附分子與大腸癌的關(guān)系認(rèn)為，該蛋白可以活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，該信號通路與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，NF-κB激活又進(jìn)一步加強(qiáng)NCAM 1對腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移作用［15］。本研究首次發(fā)現(xiàn)EiPAH患者血漿中NCAM 1較正常對照組明顯升高，其在IPAH患者血漿中也有明顯升高，但升高程度不及EiPAH患者。

由于EiPAH在國內(nèi)為新技術(shù)，目前國內(nèi)開展例數(shù)較少。該研究針對的疾病IPAH、EiPAH皆為罕見病，在擴(kuò)大驗(yàn)證的情況下，本研究的樣本量依然有限。對照組的受試者明顯年輕，可能對研究結(jié)果有一定影響，但對已有的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析可知，NCAM 1與年齡的相關(guān)性不顯著（r=0.291，P=0.179）。本課題組將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步驗(yàn)證NCAM 1與IPAH及EiPAH相關(guān)性的機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)聲明何楊柯 數(shù)據(jù)采集，論文構(gòu)思、撰寫和修訂。易鑫 數(shù)據(jù)采集，論文修訂。李卓霖 論文構(gòu)思、撰寫和修訂。黃瑋 數(shù)據(jù)分析，論文構(gòu)思和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。