小米糠多酚提取工藝的研究

李曉君 張 梅 張建豐 張紅嬌 丁東源 譚永蘭 渠志燦

(中北大學化學工程與技術學院1，太原 030051)(山西納安生物科技股份有限公司2，太原 030006)

我國谷子的年種植面積約140萬ha，產量450萬t。小米糠是谷子加工產生的副產物，年產量約30萬t[1]，不僅含有豐富的營養物質，而且富含黃酮、多酚等生物活性物質，有助于延緩衰老[2,3]、預防疾病[4]。目前，小米糠小部分被制成家畜飼料，大部分則直接廢棄，不僅造成了環境污染，還造成了資源的浪費[5]，所以開發利用小米糠有著重要的意義和廣闊的前景[6,7]。

小米糠的酚類化合物具有很強的抗氧化活性，可有效預防癌癥、心血管疾病、阿茨海默病及糖尿病等[8，9]。延莎等[10]研究發現，不同品種小米糠以晉谷21號小米多酚抗氧化能力最強，且多酚含量與抗氧化能力呈顯著相關性。山西省沁縣為小米的傳統種植區，其獨特的地理和氣候生產的小米品質優良，小米更是當地老百姓的主要收入來源。

本實驗以山西省沁縣的晉谷21號小米糠為原料，通過比較不同提取方法對小米糠多酚得率的影響，并對優選出的方法采用單因素結合響應面輔助的方法對其提取工藝進行了優化，同時對小米糠提取物的化學成分及抗氧化活性進行了分析和測試，為小米糠的綜合開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小米糠原料采自于山西省沁縣，由中北大學生物工程專業實驗室提供，小米糠過20目篩后備用。

1.2 主要藥品及試劑

石油醚、無水乙醇、甲醇、抗壞血酸，均為分析純；沒食子酸、DPPH標準品。

1.3 主要儀器設備

DHG-9023A電熱恒溫鼓風干燥箱；SOX406索式粗脂肪提取儀；JH-14-04可見分光光度計；JP-040超聲波清洗機； Ultimate3000高分辨質譜；EG823CDA-NR美的微波爐。

1.4 五種方法提取小米糠粗提物中的多酚

1.4.1 脫脂

將小米米糠去雜、磨碎、過篩，稱取一定量小米糠粉，按料液比1∶10加入石油醚索式抽提得到小米米糠脫脂產物，4 ℃下儲藏備用。

1.4.2 超聲波提取法(UE)

稱取5 g 脫脂小米糠，按料液比1∶10加入體積分數70%的乙醇，在 50 ℃、300 W 條件下超聲波提取40 min。抽濾得到提取液1，準確量取濾液體積，將濾渣按料液比1∶6重新加入體積分數70%的乙醇，超聲條件不變，結束后抽濾得提取液2，合并兩次提取液，記錄提取液總體積。

1.4.3 冷浸提取法(CSE)

小米糠與乙醇混合物(料液比1∶10，下同)在常溫條件下浸泡 24 h(每隔30 min搖晃一次錐形瓶，盡量使其完全反應)，其他條件與超聲波提取處理相同均為兩次提取，下同。

1.4.4 熱回流法提取法(HRE)

小米糠與乙醇混合物在80 ℃ 條件下進行熱回流提取80 min，其他條件與超聲波提取處理相同。

1.4.5 閃式提取法(FE)

小米糠粉碎過80目篩，然后與乙醇混合物以12 000 r/min提取1 min，其他條件與超聲波提取處理相同。

1.4.6 微波提取法(ME)

小米糠與乙醇混合物放入微波爐每隔20 s間歇微波提取 1 min，微波功率800 W，其他條件與超聲波提取處理相同。

1.4.7 多酚得率的測定

參考何志勇等[11]方法，以沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，做標準曲線，回歸方程為：y=1.313 1x-0.028 5 ，R2=0.996 7，通過標準曲線計算上清液中多酚的含量，實驗重復3次。

結合1.4.1，計算多酚得率X：

(1)

式中：Y為提取液中多酚的質量分數/%；V為提取液的總體積/mL；M為小米糠原料的質量/g。

1.4.8 多酚清除DPPH·能力測定

用甲醇將多酚提取物樣品稀釋至不同濃度，每個濃度的樣品取0.3 mL 加入試管中，加入2.7 mL 60 μmol/L的DPPH甲醇溶液，室溫避光反應30 min，于518 nm 處測定吸光度值。以含有0.3 mL甲醇和2.7 mL DPPH 溶液為空白樣品，以VC作為陽性對照，所有實驗重復3次。根據式(2)計算 DPPH· 清除率。

(2)

式中：A0為DPPH 空白對照的吸光度值；AS為樣品與 DPPH 反應后的吸光度值。

1.5 小米糠多酚提取工藝優化

考慮到超聲提取小米糠多酚得率最高且同等條件下抗氧化能力較強，因此選擇超聲提取進行單因素及響應面優化實驗。

1.5.1 單因素實驗

稱取小米糠 5.0 g 于錐形瓶中，在多組預實驗的基礎上，選取料液比(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL)、顆粒度(10、20、40、60、80 目)、提取溫度(20、30、40、50、60 ℃)、提取時間(20、30、40、50、60 min)、超聲功率(180、210、240、270、300 W)、乙醇體積分數(50%、60%、70%、80%、90%)，考察各單因素在超聲波輔助提取時對多酚得率的影響。料液比1∶10(g/mL)、顆粒度40目、提取溫度50 ℃、提取時間40 min、超聲功率240 W、乙醇體積分數70%為每個單因素除自身以外的固定值。

1.5.2 響應面優化

通過單因素實驗中各因素對小米糠多酚得率的影響，選取料液比、顆粒度、提取溫度、提取時間4種影響較大的因素為自變量，多酚得率為因變量，利用Design-Expert 8.0.6軟件設計四因素三水平響應面實驗，響應面因素與水平設計見表1。

表1 響應面實驗設計表

1.6 小米糠多酚組成分析

1.6.1 色譜條件

色譜柱：Innovation Ultimate C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速0.2 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量2 μL；檢測波長325 nm；流動相A水/甲酸=99.5/0.5；流動相B為水/乙腈/甲酸=19.5/80/0.5。

流動相洗脫程序：50 min內B由6%升高至50%；5 min內B由50%降低至6%；6% B維持5 min，共60 min。

1.6.2 質譜條件

離子源(ESI)噴霧電壓3 500 V；(-)離子模式掃描；質量掃描范圍m/z100～1 000；干燥氣和霧化氣為氮氣；干燥氣流9 mL/min；霧化氣壓力40.0 psi；離子源溫度 300 ℃。

1.7 數據處理

所有實驗均重復3次，使用Origin2019繪圖，使用SPSS22.0進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 5種提取方法對多酚得率及清除DPPH·能力影響

2.1.1 多酚得率

由圖1得出，UE(超聲波提取)的得率顯著高于其他4種提取方法(P<0.05)；CSE(冷提法)和FE(閃提法)與ME(微波法)和HRE(熱回流)比較，多酚得率偏高，且無顯著性差異(P>0.05)，原因可能是CSE和FE的提取溫度遠低于ME和HRE時的提取溫度，溫度較高會導致多酚類物質受熱分解，得率下降。又因UE操作方便，提取條件可控制性強，多酚得率較高，所以選擇UE進行實驗。

圖1 5種提取方法對小米糠多酚得率的影響

2.1.2 DPPH·清除率

由圖2可知，其中超聲波提取時提取物對DPPH·的清除率在2.5 g/L時可達51.57%，顯著高于同等濃度的其他4種方法提取物(P<0.05)，但均低于VC標準物的清除率。且超聲波提取的提取物濃度在6.0 g/L時對DPPH·的清除率達到80.45 %，顯著高于其他提取物在此濃度時的清除率(P<0.05)，又因超聲提取具有操作方便、條件易于控制、節能環保等優點，所以選擇超聲波提取效果最佳。

圖2 5種提取方法對小米糠多酚清除DPPH·的影響

2.2 小米糠多酚提取工藝

2.2.1 單因素實驗

由圖3可以得出，隨著料液比的增大，多酚得率呈現先增后減的趨勢，在料液比為1∶10時得率最高，為1.703%，與另外4種料液比多酚得率相比差異顯著(P<0.05)；當料液比繼續增大時，多酚得率反而降低，這可能由于多酚提取物的氧化導致，料液比1∶12和1∶14相比多酚得率差異不顯著。研究表明，提取原料和提取溶劑的濃度梯度是提取物溶出的動力，較大的濃度梯度有助于提取物的溶出，但當此濃度梯度達到一定限度時，繼續增加濃度梯度對提取物的溶出反而起抑制作用[12]，因此料液比選擇1∶10 g/mL最適宜。

圖3 各因素對小米糠多酚得率的影響

隨著樣品顆粒的減小，多酚得率越無顯著性差異，顆粒度為10、80目及20、60目時多酚得率沒有顯著性差異(P>0.05)，但顯著低于顆粒度為40目時的多酚得率(P<0.05)，為1.709%，這可能是因為在一定濃度內，隨著樣品顆粒的減小，物料與溶劑接觸更加充分，從而增加了傳質效率，有利于小米糠醇溶性提取物的提取，當樣品顆粒繼續減小，多酚得率反而降低，這可能是因為樣品顆粒過小堵塞濾紙，導致濾液損失，得率降低。因此顆粒度選擇40目最適宜。

提取溫度是小米糠多酚提取過程中重要的影響因素，在料液比、顆粒度、提取時間、超聲功率、乙醇體積分數不變的條件下，多酚得率在一定范圍內隨溫度的升高而增加，但當溫度達到50 ℃時，得率達到最高，顯著高于其他4個提取溫度(P<0.05)，繼續升高溫度多酚的得率反而下降，可能是由于溫度的升高，破壞了多酚的結構，進而導致得率下降，因此提取選擇溫度選擇50 ℃最適宜。

由圖3可知，隨著提取時間的延長多酚得率先升高后降低。提取時間為40 min時多酚得率顯著高于其他提取時間(P<0.05)，為1.766%，當提取時間再增加，多酚得率反而下降，這可能是因為多酚已經完全溶出，提取時間再增長，多酚得率不會再增加，還可能會由于熱效應導致其氧化分解成其他物質以至于得率下降，因此提取時間選擇40 min最適宜。

由圖3可以看出，超聲功率對多酚得率的影響較小，表現為曲線平緩，且5個功率下多酚得率并無顯著性差異(P>0.05)且5種乙醇體積分數對小米糠多酚得率無顯著性影響(P>0.05)。

2.2.2 響應面優化

通過軟件計算分析，得到4個實驗因素影響1個響應值的數學模擬方程，見表2。

表2 響應面優化實驗設計與結果

2.2.2.1 響應因子顯著性分析及方程擬合效果分析

對表3中的因子進行回歸擬合，得到回歸方程：R(%)=1.54-0.026A-0.003B-0.00423C+0.00853D+0.017AB+0.007AC-0.035AD+0.02BC-0.00325BD-0.007CD-0.029A2+0.031B2+0.046C2+0.069D2。

表3 響應面模型回歸方程的方差分析

2.2.2.2 交互作用影響結果

由響應面實驗分析結果可知，液料比和顆粒度、提取溫度、提取時間之間的交互關系非常顯著，顆粒度和提取溫度、提取時間以及提取溫度和提取時間之間的交互交互關系較為顯著。4個因素對多酚得率都有一定的影響作用，這與回歸方差分析結果相吻合。

2.2.2.3 最優方法驗證

獲得小米糠多酚超聲提取最佳工藝條件為液料比9.83 mL/g、 顆粒度58.46目、提取溫度48.20 ℃、提取時間48.05 min，多酚得率為1.742%。考慮到實際應用過程中操作簡便，將工藝條件修正為液料比10∶1 mL/g、顆粒度60目、提取溫度48 ℃、提取時間48 min，在此最佳條件下，進行3次平行實驗驗證，得到多酚得率均值為1.726%，與預測值偏差0.91%，表明該模型能較好的預測多酚得率。

2.3 最佳條件下小米糠多酚清除DPPH·能力

如圖4所示，最佳工藝條件下提取得到的小米糠多酚清除DPPH·的能力隨提物濃度的增加而增大，當提取物濃度為6 g/L時小米糠多酚的清除能力可達82.50%，但顯著低于同等濃度下VC的清除率93.26%(P<0.05)，為小米糠的綜合開發利用提供了依據。

圖4 最佳工藝條件下小米糠多酚清除DPPH·能力

2.4 小米糠多酚組成鑒定結果

通過小米糠多酚化合物的離子流色譜圖，采用 HPLC-ESI-MS 進行定性分析，實驗質譜分析采用(-)離子模式，各小米米糠多酚化合物的相對分子質量即為質荷比值(m/z)加1，由此得到小米米糠多酚中各化合物的分子量。通過與相關文獻報告進行比對，并參考國內外相關文獻報道，可初步推斷小米糠多酚組成成分。主要峰所對應的質譜圖見圖5、圖6，采用質譜分析方法，通過高分辨質譜擬合的分子式，對其質荷比和分子量進行了測定。

圖5 小米糠多酚A物質的質譜

圖6 小米糠多酚B物質的質譜圖

根據圖5、圖7可知，物質 A 的保留時間為10.34 min，質荷比(m/z)為329.23，高分辨質譜擬合的分子式為C14H18O9，根據數據庫檢索和文獻報道[13]，推測該化合物為香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷。

圖7 小米糠多酚液質聯用色譜圖

根據圖6、圖7可知，物質B的保留時間為10.78 min，質荷比(m/z)為207.14，高分辨質譜擬合的分子式為C11H12O4，根據數據庫檢索文獻報道[14],推測該化合物為阿魏酸甲酯。

3 結論

5種提取方法中，采用超聲提取得到的小米糠多酚得率最高，為1.55%；小米糠多酚濃度為6 g/L時對DPPH·的清除率可達80.45%；通過單因素和響應面優化得到的小米糠多酚最佳提取工藝條件為：液料比10∶1 mL/g、顆粒度60目、提取溫度48 ℃、提取時間48 min 、超聲功率240 W、乙醇體積分數70%，在此條件下小米糠多酚得率為1.726%，且在多酚濃度為6 g/L時對DPPH·的清除率提高了2.05%；HPLC-ESI-MS結果表明，小米糠多酚中含有香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷和阿魏酸甲酯。小米糠不僅營養豐富，且富含多酚等抗氧化活性物質，具有開發為一種新型抗氧化劑的潛力。