超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定大米中14種農藥殘留

朱 琳 張 蕊 張 冰 葉 金 王松雪王松山 郭寶元 張志軍 劉鑫輝

(國家糧食和物資儲備局科學研究院1，北京 100037)(呂梁學院2，呂梁 033000)

“民以食為天，食以安為先”，我國是一個人口大國，糧食安全是關系著國計民生的重大問題，尤其是新冠疫情爆發以來，更突顯了糧食安全的重要性。我國是世界上最大的稻米生產國，也是最大的稻米消費國，2019年，我國水稻產量達20 961萬t[1，2]。農藥的使用保障了水稻生產免受病蟲草害的威脅，在保障其穩產高產和品質安全中起到重要的作用，同時，農藥作為一種人造化學品，其具有明顯的生物學效應，對人體和環境都存在著明顯的危害[3]，因此，世界各國對糧食和環境中的農藥殘留有嚴格的限定。我國的食品安全國家標準GB 2763—2019規定了34種農藥及其代謝產物在大米中的殘留限量[4，5]。依據國家糧食和物資儲備局推動的“優質糧食工程”要求[6]，根據大米樣品基質的特點，從上述34種農藥中，選擇14種農藥殘留進行了重點監測。

目前，現有農藥殘留檢測的國標方法主要采用GPC和SPE等凈化方法[7-9]，QuECHERS凈化方法報道較多[10,11]，但是由于農藥品種較多，其理化性質相差較大，采用現有的凈化方法，難免會造成目標物的損失。隨著儀器靈敏度和抗干擾能力的提升，進一步降低了儀器對樣品前處理的要求，逐漸出現了樣品提取液直接稀釋無需凈化的方法，大幅度的降低了前處理的時間和步驟，減少了前處理成本，同時也避免了復雜前處理導致的目標物損失，且適用于多目標物的同時分析[12]。本研究通過優化實驗條件，建立了一種無需使用特殊凈化材料，可快速檢測大米中14種農藥殘留的超高效液相色譜-三重四極桿質譜(UPLC-MS/MS)方法，為有效監測大米中的農藥殘留提供了有力的技術支持。同時，所建立的方法前處理與真菌毒素前處理基本一致[12，13]，為后續進行真菌毒素與農藥殘留協同監測提供了可能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米：市售，共9份樣品。

農藥標準品：多菌靈(carbendazim)、甲萘威(carbaryl)、異丙威(isoprocarb)、芐嘧磺隆(bensulfuron-methyl)、敵稗(propanil)、稻瘟靈(isoprothiolane)、禾草敵(molinate)、馬拉硫磷(malathion)、喹硫磷(quinalphos)、稻豐散(phenthoate)、敵瘟磷(edifenphos)、甲基嘧啶磷(pirimiphos-methyl)、甲基毒死蜱(chlorpyrifos-methyl)、丁草胺(butachlor)；甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨：色譜級；實驗用水。

1.2 儀器與設備

6470A三重四極桿液質聯用系統，1290 Infinity II液相色譜系統，H1750臺式高速離心機，3-30k高速冷凍離心機，VX-III多管渦旋振蕩器，WH-866旋渦混合器。

1.3 標準溶液的配置

分別用甲醇配制14種農藥(多菌靈、甲萘威、異丙威、芐嘧磺隆、敵稗、稻瘟靈、禾草敵、馬拉硫磷、喹硫磷、稻豐散、敵瘟磷、甲基嘧啶磷、甲基毒死蜱、丁草胺)混合標準的儲備液，于-20 ℃保存；使用空白大米提取液(按照1.4制備)將混合標準溶液逐級稀釋，配制成不同濃度的基質匹配標準工作液，備用。

1.4 樣品處理

樣品經粉碎過40目篩后，準確稱取5.00 g于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水-乙酸(70∶29∶1)混合溶劑，渦旋搖勻20 min后，以4 000 r/min離心10 min使固液分離。準確轉移0.5 mL上清液于1.5 mL離心管中，加入0.5 mL去離子水稀釋，渦旋混勻1 min，然后在 4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm的濾膜過濾，待測[12，13]。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱為Waters CORTECSTMUPLC C18柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)，保護柱為CORTECSTMUPLC C18柱(2.1 mm×5 mm，1.6 μm)；柱溫35 ℃；進樣量2 μL。流動相A為含0.1%(體積分數)的甲酸和1 mmol /L甲酸銨的水溶液，流動相B為甲醇，流速；0.4 mL/min。

梯度洗脫條件：0 min，95%A，12 min，5%A，后運行5 min。

1.5.2 質譜條件

帶噴射流技術的ESI源(簡稱AJS)，干燥氣溫度為250 ℃，干燥氣流速為7 L/min；鞘氣溫度為325 ℃；鞘氣流速為11 L/min；毛細管電壓為3.5 kV；DMRM正離子掃描模式；經優化后，各農殘母離子及定量、 定性子離子保留時間、碎裂電壓及碰撞能量見表1。

表1 14種農藥殘留質譜條件

2 結果與分析

2.1 大米樣品農殘種類

本研究選擇14種(多菌靈、甲萘威、異丙威、芐嘧磺隆、敵稗、稻瘟靈、禾草敵、馬拉硫磷、喹硫磷、稻豐散、敵瘟磷、甲基嘧啶磷、甲基毒死蜱、丁草胺)農藥，其主要為我國食品安全限量標準規定的大米中使用較為頻繁且在液質上響應較好的農藥[6-9]。

2.2 農殘質譜條件的優化

在ESI源正離子模式下，對14種農殘單標溶液進行母離子全掃描，再對各自子離子進行全掃描，每種農殘選擇2個響應值高的特征離子對作為定量及定性離子對，并進行MRM及DMRM參數的優化，優化參數見表1。每種農殘均以其相應的加氫的準分子離子作為特征母離子。

2.3 農殘色譜分析方法的優化

通過對流動相含0.1%(體積分數)的甲酸和1 mmol/L甲酸銨的水溶液與甲醇梯度洗脫條件進行優化，以確定各農殘在C18柱上的最佳分離率及檢測時間，經優化，利用C18柱分離的14種農藥提取離子色譜圖詳見圖1，峰6與峰7、峰8，峰9與峰10的提取離子色譜圖會有重疊，但各峰的定量離子和定性離子是不同，因此，不影響其定量分析。

2.4 農殘前處理方法的選擇

注：峰1：多菌靈，峰2：甲萘威，峰3：異丙威，峰4：芐嘧磺隆，峰5：敵稗，峰6：稻瘟靈，峰7：禾草敵，峰8：馬拉硫磷，峰9：喹硫磷，峰10：稻豐散，峰11：敵瘟磷，峰12：甲基嘧啶磷，峰13：甲基毒死蜱，峰14：丁草胺。圖1 基于UPLC-MS/MS的C18色譜柱DMRM掃描模式下14種農藥提取離子(EIC)色譜圖

在前期方法開發的基礎上[12，13]，本研究采用直接提取稀釋離心法用于大米樣品中多農藥的快速前處理，提高了提取效率。使用本前處理方法對大米樣品進行處理，上機檢測溶液澄清透明，對近百份大米基體樣品進行檢測，色譜柱柱壓未見顯著升高，方法靈敏度未發生顯著下降，表明本前處理方法不會對色譜柱和質譜儀造成明顯的污染，適用于大量大米樣品的檢測。

2.5 大米樣品農殘方法學驗證

2.5.1 基質效應及線性范圍

基質效應是基質匹配標準曲線斜率與純溶劑配制標準曲線斜率的比值，該比值用來評估基質對質譜響應的抑制或增強效應(SSE)。該比值等于或接近1時(在0.85～1.15)，表明基質效應不明顯；小于0.85時，表明存在明顯離子抑制作用，大于1.15時，表明存在明顯離子增強作用[13]。大米樣品14種農殘的基質效應及線性范圍詳見表2。

表2 14種農殘的基質效應及線性范圍

表2(續)

由表2可知，大米中14種農藥基質效應及其線性關系，其中有9種農殘(多菌靈、甲萘威、異丙威、芐嘧磺隆、敵稗、稻瘟靈、喹硫磷、稻豐散、敵瘟磷)未有明顯的基質效應，5種農殘(禾草敵、馬拉硫磷、甲基嘧啶磷、甲基毒死蜱、丁草胺)有明顯的基質效應，但這14種農殘基質標液在線性范圍內均線性相關。

因此，在進行大米樣品檢測時，為了提高方法的準確性，降低基質效應的影響，需采用基質匹配曲線進行定量。

2.5.2 定量限及檢出限

以性噪比S/N≥10確定各農殘的定量限 (LOQ)，并在定量限濃度水平進行加標回收以驗證各農殘的定量限(LOQ)，以性噪比S/N≥3確定各農殘的檢出限(LOD)。14種農殘定量限和檢出限詳見表3。

由表3可知，有11種農藥(多菌靈、甲萘威、異丙威、芐嘧磺隆、敵稗、禾草敵、馬拉硫磷、喹硫磷、稻豐散、敵瘟磷、甲基毒死蜱)在1～100 μg/kg添加水平下的回收率為87.0%～115.6%，相對標準偏差為0.8%～8.7%，定量限為1 μg/kg，有2種農殘(甲基嘧啶磷和稻瘟靈)在2～100 μg/kg添加水平下的回收率為91.4%～115.2%，相對標準偏差為0.5%～8.3%，定量限2 μg/kg，丁草胺在5～100 μg/kg添加水平下的回收率為89.0%～102.1%，相對標準偏差分別為0.9%～1.3%，定量限為5 μg/kg。這14種農殘在相應的定量限范圍內的加標回收率為87.0%～115.6%，相對標準偏差為0.5%～8.7%，檢出限均小于0.4 μg/kg。由此可見，該方法不僅回收率高，精密度高，而且定量限大大低于食品安全國家標準GB 2763—2019相應農殘限量的要求，因此，本方法可以滿足日常檢測和監測需求。

2.5.3 回收率及精密度

取空白大米樣品，分別添加低、中、高三種濃度水平的混合標準溶液，按照“1.4”樣品處理方法進行處理，其中，低濃度、高濃度加標水平進行3次重復實驗，中濃度水平進行6次重復性實驗，14種農殘加標回收率及相對標準偏差結果詳見表3。

表3 14種農殘加標回收率、精密度及定量限、檢出限及最大殘留限量

2.6 大米實際樣品的測定

利用開發的UPLC-MS/MS的方法對市售的9個大米樣品進行測試分析，經分析可知，市售9份大米樣品中有4份樣品存在農藥殘留，占比總樣品量的44%，其中多菌靈檢出2份，檢出率為22%，稻瘟靈檢出4份，檢出率為44%，其中農藥殘留總量最高的樣品中稻瘟靈殘留量為166.8 μg/kg，多菌靈留量為2.4 μg/kg，遠低于GB 2763—2019規定的稻瘟靈1 mg/kg的限量，多菌靈2 mg/kg的限量。從本次市場初步篩查的結果來看，市售9份大米中14種農藥均未超過食品安全國家標準GB 2763限量要求，因此，本次所采集的市售大米在農藥殘留方面是相對安全的，可放心食用。

3 結論

基于超高效液相色譜-三重四極桿質譜(UPLC-MS/MS)技術，建立了同時檢測大米中14種農藥殘留的方法，樣品經提取、稀釋、離心、過濾后直接上機，減少前處理的目標物損失，采用加標回收法驗證了方法準確度和精密度，本方法14種農殘加標回收率為87.0%～115.6%，相對標準偏差為0.5%～8.7%，多菌靈、甲萘威、異丙威、芐嘧磺隆、敵稗、禾草敵、馬拉硫磷、喹硫磷、稻豐散、敵瘟磷、甲基毒死蜱定量限為1 μg/kg，甲基嘧啶磷和稻瘟靈定量限為2 μg/kg，丁草胺定量限為5 μg/kg，14種農殘的檢出限均小于0.4 μg/kg，本方法的定量限和檢出限遠遠低于食品安全標準大米中農藥最大殘留限量的要求，本方法適用于大量大米樣品農藥殘留的快速準確定量分析，同時，該方法前處理與真菌毒素前處理基本一致[12，13]，為后續建立真菌毒素與農藥殘留協同監測方法提供了可能，為進一步保障我國大米質量安全提供了技術保障。