結晶樣視網膜色素變性中與CYP4V2基因相關的致病突變

楊極，韋春玲，張娟，胡竹林，焦康為

0引言

結晶樣視網膜色素變性(Bietti crystalline corneoretinal dystrophy，BCD)是一種常染色體隱性遺傳性眼病。此病早期病情隱匿，患者往往因視功能損害不明顯而未及時就診，臨床主要特征為眼底視網膜內白色結晶樣物質沉積，脈絡膜血管硬化，或伴有角膜邊緣營養不良[1]。BCD在歐美人群中較少見，其致病基因為CYP4V2，有學者報道我國BCD致病基因頻率為0.005，群體患病率約為1/24000[2]。大部分患者在10～40歲出現視力減退、夜盲、中央暗點等癥狀，隨后發展為周邊視野缺失和中心視力缺損，通常在40或50歲后視力下降至法定盲[3-4]。2015年孟曉紅[5]對184個BCD家系中215例患者進行大規模臨床檢查和基因診斷后，充分揭示了中國人群BCD臨床特點和基因突變譜，目前已知的致病性CYP4V2基因突變位點已達82個，故對患者進行臨床診斷的同時進行基因篩查有利于增加疾病的精確診斷率，為進一步深入研究BCD的發病機制和為相關治療提供依據。本研究對2個BCD家系進行Sanger測序，篩查患者的致病突變，現將結果報道如下。

1對象和方法

1.1對象描述性研究。收集2019-01/09就診于云南省第二人民醫院眼科門診并確診為BCD的先證者2例。從先證者出發，詳細詢問其家族遺傳史，繪制家系圖，并收集家族中其他成員納入研究。共搜集BCD家系2個，家系1有明確的家族遺傳病史，先證者及其哥哥，妹妹均患有BCD。家系2中先證者為散發病例，其父母已故。其中2例先證者均為女性。本研究遵守《赫爾辛基宣言》，經云南省第二人民醫院倫理委員會批準，參與本研究的成員均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1檢查方法對2例BCD先證者進行了詳細的病史、家族史詢問，同時進行了全面的眼科檢查。臨床檢查包括裸眼視力、色覺、最佳矯正視力(BCVA)、裂隙燈下眼前段及眼底檢查、眼底照相、眼部光學相干斷層成像技術(OCT)檢查、眼底熒光造影檢查。

1.2.2基因檢測簽署知情同意書后，使用EDTA抗凝管采集先證者及參與研究的家族成員靜脈血5mL，用基因組DNA提取試劑盒提取外周血DNA。提取的DNA需滿足樣本濃度均>50ng/μL，D(260nm)/D(280nm)為1.8～2.0，DNA樣本-20℃冰箱保存[6]。根據美國國家生物技術信息中心提供的CYP4V2基因序列和參考文獻[4]設計引物，利用PCR技術擴增目標DNA序列。采用傳統50.0μL PCR擴增反應體系，加入DNA模板1.0μL，上、下游引物各1.0μL，2×EasyTaq R CR SuperMix 25.0μL，加入超純水22.0μL。94℃預變性5min，94℃變性30s，50℃～65℃退火30s，72℃延伸1min，共反應35個循環，最后72℃延伸5min。操作步驟及流程嚴格按照云南省第二人民醫院實驗中心生化實驗室要求進行。

圖1 患者家系資料 A：先證者1家系圖;B：先證者2家系圖。

通過dbSNP，ExAC Browser，the 1000 GenomesProject，Genome Aggregation Database等數據庫獲得變異的最小等位基因頻率，運用 Mutation Taster、SIFT、PolyPhen2、GERP++、REVEL等生物信息學蛋白功能預測軟件來進行危害性預測，并制作三維蛋白模型結構[7-9]。采用同源序列多重比對，結合OMIM、NCBI等數據庫[8]，利用UGENE

軟件分析突變位點在不同物種間的保守型。依據美國醫學遺傳學與基因組學學會(ACMG，2015)分級標準對突變位點進行致病性判斷[10]。

2結果

2.1 BCD患者臨床特征先證者F1 II3(圖1A)，女性，33歲，主訴為“雙眼漸進性視力下降1a”，BCVA：OD：0.05，OS：0.2。眼前節均未見明顯異常，眼底可見大量密集黃白色結晶樣顆粒物質沉積,后極部視網膜廣泛脫色素至顏色變淡(圖2A～F)。色覺檢查:紅綠色弱。后極部OCT提示：橢圓體帶及色素上皮層萎縮，僅黃斑區少許殘留，在萎縮區可見大量細小顆粒樣物質均勻堆積，其下脈絡膜毛細血管及中血管層相應萎縮，清晰可見大血管輪廓(圖2G、H)。熒光造影檢測可見結晶顆粒未顯影(圖2I、J)。哥哥F1 II1，男性，44歲，BCVA：OD：0.02，OS：0.05，妹妹F1 II5，女性，31歲，BCVA：OD：0.1; OS: 0.02，均可見眼底大量密集黃白色結晶樣顆粒物質沉積。

圖2 同一患者影像學資料 A、B：廣角眼底照，不同程度的結晶樣物質沉積，伴視網膜色素上皮層萎縮及色素沉著；C、D：自發熒光可見視網膜結晶樣物質沉積區域低熒光；E、F：眼底照，不同程度的結晶樣物質沉積；G、H：OCT檢查橢圓體帶及色素上皮層萎縮，僅黃斑區少許殘留，在萎縮區可見大量細小顆粒樣物質均勻堆積，其下脈絡膜毛細血管及中血管層相應萎縮，清晰可見大血管輪廓；I、J：熒光造影可見結晶樣物質熒光遮蔽。

先證者F2 II2(圖1B)，女性，41歲，主訴為“雙眼漸進性視力下降7a”，BCVA：OD：0.05; OS：0.12。眼前節均未見明顯異常，眼底見不同程度的結晶樣物質沉積，伴視網膜色素上皮層萎縮及色素沉著。女兒F2 Ⅲ 1，視力正常。

2.2 Sanger測序結果對先證者F1 II3和其近親屬F1 II1，F1 II5的外周血DNA進行Sanger測序后，檢測出CYP4V2基因上存在c.802-8_810del17insGC的純合突變(圖3A～C)。根據ACMG指南(PVS+PS1+PM2)，該變初步判定為致病性變異。PVS：該變異為零效變異，可能導致基因功能喪失。PS1：HGMD數據庫已有該位點的致病性報道。PM2：在dbSNP，ExAC Browser，the 1000 Genomes Project等數據庫中為低頻變異。同時保守性分析顯示此突變位于不同物種間氨基酸高度保守的位置。

由于先證者F2 II2的父母、哥哥已故，無法進行家系共分離驗證，對先證者和其女兒的外周血DNA進行全外顯子測序后，檢測出先證者CYP4V2基因上存在和F1家系一致的c.802-8_810del17insGC雜合突變，同時F2 II2還存在c.219T>A(p.F73L)突變(圖3D～E)。依據ACMG指南(PS1+PM2)，c.219T>A(p.F73L)為疑似致病性變異，PS1：HGMD數據庫已有該位點的致病性報道。PM2：在正常人數據庫中為低頻變異。同時生物信息學蛋白功能預測軟件MutationTaster、GERP++、PolyPhen2均預測此突變為有害。保守性分析顯示c.802-8_810del17insGC，c.219T>A(p.F73L)突變位于不同物種間氨基酸高度保守的位置(圖4A、B)。3D蛋白預測模型提示c.219T>A(p.F73L)突變影響蛋白質的局部構像(圖4C、D)。先證者F2 II2無BCD癥狀的女兒發現CYP4V2基因上存在c.219T>A(p.F73L)雜合突變(圖3F)。

圖3 Sanger測序結果 A～C：家系1中II3，II1，II5檢測出CYP4V2基因上存在c.802-8_810del17insGC的純合突變；D～E：F2 II2檢出c.219T>A(p.F73L)和c.802-8_810del17insGC雜合突變；F：F2 III1檢出c.219T>A(p.F73L)雜合突變。

圖4 保守性分析和蛋白三維結構預測結果 A、B：保守性分析顯示c.8028_810del17insGC(H262)，c.219T>A(p.F73L)(F73)突變位于不同物種間氨基酸高度保守的位置；C、D：3D蛋白預測模型提示c.219T>A(p.F73L)突變影響蛋白質的局部構像。

3討論

BCD(OMIM#210370)是一類常見的常染色體隱性遺傳性視網膜變性疾病，在1937年由Bietti醫生首次報道，其在視網膜色素變性疾病中比例高達18.5%，在中國人群中發病率遠高于歐美人群[5, 11]。BCD的致病基因為CYP4V2，位于4q35-qter，由11個外顯子組成，編碼525個氨基酸，屬于細胞色素氧化酶P450(CYP450)超家族[12]。目前CYP4V2導致BCD發病的機制研究還未完全明了，有研究表明CYP4V2參與脂肪酸代謝，BCD患者血清三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和正常人群存在差異，但CYP4V2突變對全身各組織器官影響較小，推測其發病方式可能為基因突變影響了視網膜色素上皮細胞的脂質代謝而致病[13]。BCD具有高度遺傳異質性，至今已發現的BCD致病突變位點達82個，絕大部分為錯義突變、缺失以及無意突變，涉及所有11個外顯子區域，對BCD患者進行進一步，尤其是致病基因CYP4V2相關突變位點篩查明確病因具有重要意義[14-15]。

本研究應用Sanger測序技術對4例BCD患者和1例BCD患者健康的女兒進行了基因檢測。通過基因檢測，我們發現在CYP4V2基因上存在c.219T>A(p.F73L)，c.802-8_810del17insGC突變。本文研究的2個BCD家系，先證者均具有明顯的BCD表現，其中F1 II3和其近親屬II1，II5均具有多年的夜盲病史，伴有視力下降，眼底存在典型的結晶樣物質沉積，并檢測到c.802-8_810del17insGC純合突變。先證者F2 II2眼底可見結晶樣物質沉積，同時存在c.219T>A(p.F73L)，c.802-8_810del17insGC復合雜合突變，先證者F2 II2的女兒發現CYP4V2基因上存在c.219T>A(p.F73L)雜合突變，但先證者F2 II2女兒未出現BCD的癥狀。

本研究發現的c.802-8_810del17insGC突變為中國人群中CYP4V2基因最常見的突變方式，在CYP4V2基因突變比例中占62.6%，此突變可導致氨基酸編碼終止進而影響蛋白功能的發揮。Lai等[3]研究報道了c.802-8_810del17insGC突變與表型間的關聯，發現突變眼電圖上可顯示低Arden比，并表現出不可記錄的暗適應FERG，以及不可記錄的30Hz閃爍ERG。Gekka等[16]比較了2例CYP4V2突變患者的臨床特征，發現純合缺失/插入突變(c.802-8_810del17insGC)的患者均出現了視野受損。1例患者的視桿、視錐細胞ERG振幅嚴重降低。相反，另1例患者雖然有復合雜合子突變，臨床表現輕微，視錐和視桿細胞的ERG振幅未受到明顯影響。但是發病年齡和病程對視網膜功能改變相關因素的影響未見報道，不存在明顯的基因型-表型關聯。雖然表型與基因型之間存在較大差異，但表型的嚴重程度與疾病的病程有關，發病越早，嚴重表型持續時間越長，本研究中F1 II1已有夜盲病史10余年，患者目前44歲，已雙眼失明。

先證者F2 II2檢測到的c.219T>A(p.F73L)突變在2014年由Yin等[17]首次報道，此突變在健康人群中未被報道，在dbSNP，ExAC Browser，the 1000 Genomes Project等數據庫中為低頻變異，而73號位點的苯丙氨酸在多物種間均為一個高度保守的序列，三維蛋白結構預測也可見此突變影響了局部蛋白質的二級結構，進而影響了蛋白質的疏水性和穩定性。CYP4V2基因編碼跨膜氨基酸與18個α螺旋以β折疊和卷曲的形式構成跨膜結構，此結構可與亞鐵血紅素相識別。錯義突變可影響α螺旋與卟啉環的結合，進而導致該結構失去功能。CYP4V2基因的錯義突變一般可影響蛋白跨膜段，干擾CYP4V2蛋白與膜的整合，在酶的活性位點干擾其與卟啉環的配位[18-19]。本研究再次證明了c.802-8_810del17insGC和c.219T>A(p.F73L)突變在中國BCD人群的發病中扮演重要角色。

但是，由于BCD的高度遺傳異質性，對其了解仍然很少，基于通過研究大樣本不同BCD患者的遺傳特征，進一步闡明其致病的分子機制，不但提高該疾病診斷的準確率，對解釋BCD疾病發生發展的本質和探索其基因型和表型之間的分析就顯得尤為重要，同時可為開發該病個性化的基因治療奠定基礎。