青光眼發病機制相關信號轉導通路的研究進展

許夢涵，劉 濤

0引言

青光眼(glaucoma)是一組以特征性的視神經萎縮和視野缺損為共同特征的疾病，眼壓是其最主要的危險因素。統計學調查顯示，到2020年全球范圍內青光眼的患病人數可達到7960萬[1]，青光眼已成為我國最常見的不可逆性致盲性眼病。視網膜神經節細胞(retinal ganglion cell，RGC)是電信號傳向視神經中樞的唯一神經元，其進行性凋亡與青光眼所表現的視野缺損及視網膜神經纖維層萎縮密切相關。目前臨床中對于青光眼主要依靠藥物和手術進行治療，但并不能完全阻止RGC及軸突的進行性損害。近年來，隨著遺傳學及分子生物學的發展，對于青光眼相關信號轉導通路的研究也趨于深入，對于青光眼的治療也已不再拘泥于眼內壓的降低，視神經的保護和再生已成為當下的研究熱點。現將近年與青光眼發病機制相關的熱點信號通路研究進展綜述如下。

1 Rho/ROCK信號通路

1.1 Rho/ROCK信號通路的組成及調節Rho蛋白屬于Ras超家族，其下游最主要的效應分子為ROCK，稱為相關卷曲螺旋形成蛋白激酶[2]。Rho包含三種氨基酸序列高度同源的異構體：RhoA、RhoB及RhoC。ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，有兩種異構體：ROCK Ⅰ和ROCK Ⅱ，研究顯示ROCK Ⅰ和ROCK Ⅱ在睫狀體和小梁網中均有表達[3]。ROCK活化可使肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)磷酸化并間接抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)。ROCK被激活以后，將MLC磷酸化而發生肌絲收縮作用;也可將MLCP磷酸化，使MLCP失活，導致細胞胞漿內MLC磷酸化水平增高，間接促進肌絲收縮，而Rho或ROCK抑制劑可抑制MLCP的活性，使平滑肌擴張[2]。Rho/ROCK信號通路與小梁網的收縮和舒張、抑制神經元凋亡、保護視神經、促進視神經再生等多種生理功能有關。

1.2 Rho/ROCK信號通路與青光眼

1.2.1對房水引流的影響眼壓是青光眼最可控的危險因素，小梁網是房水循環阻力最大的部位，房水引流通道的阻力增加與原發性開角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)的發病機制有關。小梁網組織具有平滑肌細胞樣特性，其收縮與舒張影響房水的排出率。平滑肌收縮的程度主要由MLC的磷酸化水平決定，若可通過抑制Rho/ROCK信號通路來調節MLCP的活性，改變MLC的磷酸化水平，進而改變小梁組織舒張及收縮狀態，增加房水經小梁途徑引流，從而降低眼內壓，這也許為POAG的治療提供新靶點。

1.2.2保護視神經研究顯示，正常人的視神經乳頭可表達RhoA、ROCK Ⅰ和Ⅱ，但在青光眼患者中RhoA的表達顯著提高，這提示Rho/ROCK通路與青光眼視神經損傷的機制相關[4]。低血流量灌注被認為是青光眼視神經損害的關鍵因素。流行病學研究表明，眼部血液循環是青光眼病理發展的重要危險因素[5]。ROCK抑制劑可通過緩解血管痙攣，增加機體血流灌注，以提高視網膜和視神經乳頭的血流量，起到保護視神經的作用。

1.2.3抑制視神經凋亡，促進視神經再生在青光眼的發病機制中，神經營養因子的剝奪、氧化應激、膠質細胞的活化、興奮性中毒、蛋白質的錯誤折疊等均與RGC的凋亡相關。有研究顯示，在大鼠視神經損傷模型中，球內注射RhoA拮抗劑，可促進軸突再生和增加RGC存活數量[6]；在大鼠青光眼模型中，腹腔注射Rho激酶抑制劑可抑制神經元凋亡[7]；Tura等[8]還認為，ROCK抑制劑可能在一定程度上與降低星形膠質細胞的反應性有關，故能夠起到保護RGC的作用。綜上所述，特異性的Rho/ROCK通路抑制劑在降低眼內壓、增加房水外流、保護視神經、抑制RGC凋亡以及改善眼部灌注等方面均起到積極作用。

2 TGF-β/Smad信號通路

2.1 TGF-β/Smad信號通路的組成及調節轉化生長因子-β(transforming growth factor beta,TGF-β)通過細胞表面的受體信號轉導途徑調節細胞的增殖、分化、遷移和凋亡。在哺乳動物中，TGF-β有三種亞型：TGF-β1、β2、β3[9]。近年來TGF-β2成為青光眼病因研究的熱點因子。TGF-β受體(TβRs)家族包括3型受體：TβR-1、TβR-2和TβR-3[10]。Whitman[11]在果蠅和線蟲中發現Smad蛋白是TGF-β受體作用的直接底物，是其配體與受體作用信號由胞漿傳導至細胞核的中介分子。現已發現細胞內存在9種Smad因子,根據結構和功能主要可分為三個亞族：受體調節型Smad(receptor regulated Smad,R-Smad)，包括Smad 1、2、3、5、8、9;通用型Smad(common partner Smad,Co-Smad)，哺乳動物中僅有Smad 4;抑制型Smad(inhibitory Smad,I-Smad)，包括Smad 6、7。TGF-β與細胞表面的受體結合形成異源三聚體，異源三聚體通過磷酸化激活R-Smad，將信號傳遞至胞漿內，R-Smad與Co-Smad形成復合物，轉移至細胞核與靶細胞結合，細胞核中的Smad寡聚物與DNA結合后與轉錄因子結合，調控蛋白質的合成及靶基因的轉錄。I-Smads可通過受體阻斷R-Smads的磷酸化，促進受體復合物的泛素化和降解，從而抑制信號傳遞[12]。

2.2 TGF-β/Smad信號通路與青光眼人眼角膜內皮、虹膜、睫狀體、小梁網均可表達TGF-β1、TGF-β2的mRNA并轉錄[13]。POAG患者眼壓的升高與小梁網組織纖維化反應有關[14]。小梁網是人眼中內源性TGF-β2的主要來源[10]。TGF-β/Smad途徑是調節人小梁組織細胞外基質(extracellular matrix,ECM)沉積的主要通路[15]。Trivedi等[16]研究證實青光眼患者房水中TGF-β2的表達濃度遠高于非青光眼患者，并且隨著年齡的增長，患青光眼的風險增加，可能部分與這種細胞因子的增加有關，青光眼患者眼前段的特征性改變與TGF-β2的過度表達有關。TGF-β2與小梁細胞上相應的受體結合后可使小梁組織產生層黏連蛋白、多種蛋白多糖等使ECM蛋白增加[17]。有研究表明TGF-β2可誘導小梁細胞合成纖溶酶原激活物抑制劑-1(pasminogen activator inhibitor,PAI-1),PAI-1作為金屬蛋白酶組織抑制劑,可間接抑制ECM的降解，從而進一步加重ECM在小梁組織的堆積及促進小梁網細胞的凋亡[18]。通過各種機制導致ECM沉積及降解的減少，均可引起房水流出阻力的增加，致使POAG的發生。Smad7屬于抑制型Smad蛋白,對TGF-β信號通路起負調節作用。青光眼濾過術后瘢痕形成是導致手術失敗的主要原因，TGF-β是已經確定的參與瘢痕形成的主要因子，其中TGF-β2與纖維化的關系最密切。TGF-β可影響結膜囊成纖維細胞的生成、膠原合成增加，導致結膜囊組織纖維化[19]。Smad7可抑制眼球筋膜囊成纖維細胞合成1型膠原蛋白，從而抑制瘢痕的形成。抑制Smad7的生成、磷酸化均可抑制此通路，可為青光眼濾過術后瘢痕形成的基因治療提供理論基礎。

Gulab等在TGF-β/Smad與青光眼視神經病變的相關性研究中發現TGF-β2可以利用規范化Smad信號通路來刺激ECM合成人視神經乳頭(optic nerve head，ONH)細胞并進行ONH的重塑[20]。ONH存在的主要細胞類型包括ONH星形膠質細胞和篩板(LC)細胞。這些細胞通過合成生長因子(如神經營養因子)和ECM蛋白來支持RGC軸突。抑制TβR-1或阻止Smad2或Smad3可逆轉TGF-β2刺激合成ECM蛋白質的星形膠質細胞和LC細胞。因此，抑制這些下游信號可抑制青光眼ONH中ECM的重構。通過調節參與TGF-β/Smad通路產生、激活及下游的效應因子，或與TGF-β/Smad通路相關的蛋白酶、整合蛋白等，可為以TGF-β為靶點的青光眼的基因治療提供可能性策略。

3 PI3K/Akt信號通路

3.1 PI3K/Akt信號通路組成及調節磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶B(serine/threonine protein kinase,PKB；別名Akt)信號通路通過調節細胞凋亡相關因子參與細胞凋亡的過程。PI3K是由調節亞單位p85與催化亞單位p110組成的異源二聚體蛋白。p85可以通過接受來自酪氨酸激酶和G蛋白偶聯受體的信號而被活化。活化的PI3K的p85調節亞基將被聚集到臨近質膜的部位，p110亞基通過與p85亞基結合把底物磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-diphosphate,PIP2)催化為磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate,PIP3),PIP3可介導PI3K的多種生物學功能。Akt是PI3K的重要下游分子，是一種可以通過磷酸肌醇被募集到質膜而被激活的蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶。其氨基末端含有PH結構區，是與PIP3結合的主要部位，結合后Akt將從細胞質轉移到細胞膜上，并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶2(PDK2)的輔助下，分別使Akt蛋白上的蘇氨酸磷酸化位點(Thr308)和絲氨酸磷酸化位點(Ser473)磷酸化而使其激活。活化的Akt將轉移至細胞質或細胞核內進一步活化下游的靶點,進而參與細胞的生長、增殖與分化[21]。

3.2 PI3K/Akt信號通路與青光眼青光眼RGC的凋亡途徑目前認為主要為內源性線粒體途徑。Bcl-2是PI3K/Akt信號通路下游的重要效應分子，線粒體凋亡途徑中Bcl-2家族蛋白活性與PI3K/Akt信號通路密切相關。Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，其主要分布的線粒體是Bcl-2家族中抗凋亡因子與促凋亡因子互相作用的核心場所。

眼壓升高時，RGC內的Ca2+含量增加，加重線粒體Ca2+泵負擔，引起線粒體膜的去極化和線粒體DNA的突變及損傷，導致線粒體功能障礙和RGC細胞的凋亡[22-23]。線粒體受損，軸漿運輸阻斷使RGC缺血缺氧并釋放大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),刺激細胞色素C從細胞磷脂雙分子層通過Bax蛋白孔隙釋放至細胞質中，激活下游的caspases級聯反應，促使凋亡小體形成。有研究表明Bcl-2可通過與Bax結合，使Bax構象發生改變，阻止細胞色素C釋放進入細胞質，進而抑制細胞凋亡過程的啟動[24]。眼壓升高后將激活Ca2+依賴的相關細胞凋亡途徑，同時鈣調磷酸酶也被激活，進一步引起下游caspase-9的激活，導致RGC的凋亡。有研究顯示鈣調磷酸酶抑制劑可以明顯抑制caspase-9的激活，從而降低神經節細胞的凋亡，同時Bcl-2高表達可使鈣調磷酸酶的活性降低，抑制Ca2+依賴的細胞凋亡[25]。Almeida等[26]認為，Bcl-2可抑制miR-181的表達，從而保護星形膠質細胞免受氧化應激誘導的凋亡，并促進神經節細胞軸突再生。

橋粒芯糖蛋白(DSG)是構成細胞間橋粒的主要蛋白，根據其遺傳特性分4種亞型：DSG1-4。我們在前期關于原發性閉角型青光眼(primary angle-closure glaucoma，PACG)家系致病基因定位研究中，通過對先證者家系進行WES測序分析，最終篩選得到5個潛在的特異性基因，其中包含DSG1基因[27]。DSG1基因是一種Ca2+依賴型的橋粒跨膜蛋白，當細胞內Ca2+濃度上升時，DSG1即與Ca2+結合發揮生物學效應，參與細胞的代謝，同時作為信號蛋白對細胞的分化、增殖和壞死凋亡發揮重要作用。Dusek等[28]研究發現DSG1是一種新型的caspase和金屬蛋白酶底物，其裂解可能有助于在角化細胞凋亡過程中橋粒的解體，并揭示了DSG1是以前未被識別的角化細胞凋亡調節因子。侯傳勝等[29]在有關前列腺癌的研究中發現DSG2通過PI3K/Akt信號通路在原發性前列腺癌中發揮作用并成為原發性前列腺癌的關鍵預后標志物。但DSG1與PACG的相關性研究并不清楚，故我們在后期研究中將利用視網膜神經節細胞構建突變體穩定表達細胞株觀察潛在致病基因的表達水平和對細胞功能學的影響，并進一步篩選其調控機制和相關信號通路，最終明確PACG的發病機制。

4 Nrf2/Keap1/ARE信號通路

核因子E2相關因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)是細胞氧化應激反應中的關鍵因子，受Keap1的調控，通過與抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)相互作用，調節抗氧化蛋白和Ⅱ相代謝酶基因的轉錄。ARE是Nrf2蛋白介導適應性抗氧化應激反應的主要DNA結合序列。其含有一特殊性5’端的啟動序列(5-GAGTCACAGTGAGTCGGCAAAATT-3)，該序列能被多種親電性和氧化性化合物激活，從而啟動Ⅱ相代謝酶和抗氧化酶基因的表達，保護細胞組織正常功能。植物源性強的Nrf2誘導劑例如：姜黃素、梔子素等可激活Nrf2信號通路。

Wang等[30]通過模擬高眼壓60min后缺血再灌注模型，定量分析神經節細胞層的胞體和TUNEL陽性凋亡細胞，并評估退化毛細血管的數量，再通過膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表達水平檢測膠質細胞的活化情況，發現姜黃素有保護視網膜神經元和微血管免受缺血再灌注的損傷作用。Nrf2介導的信號通路可以保護氧化應激所致的視神經退行性病變，Nrf2誘導劑對眼球的細胞損傷具有保護性作用，可減輕氧化應激引起的RGC的死亡。Koriyama等在體內及體外實驗中均證明長效梔子素衍生物能誘導HO-1的產生，從而通過Nrf2-ARE途徑保護RGC免受氧化應激[31]。Yang等通過小鼠實驗發現Nrf2在視網膜缺血再灌注損傷中對神經元和毛細血管變性具有保護作用[32]。Feng等[33]在視神經損傷小鼠模型中發現在視神經損傷后Nrf2-ARE通路被激活，并在30min時達到峰值，并啟動了一系列的視神經損傷防御機制。這些發現為分析其保護功能和潛在機制以及探索針對Nrf2-ARE通路的視神經保護新藥物提供了實驗證據。

5 BDNF/TrkB信號傳導通路

腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)通過與酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor，TrKB)相互結合，通過激活下游多個重要信號通路發揮其生物學效應。在有關BDNF/TrkB通路對青光眼治療的影響相關研究中發現BDNF/TrkB通路對RGC的生存及其重要，青光眼損傷的持續時間和嚴重程度影響BDNF和TrkB的表達，特別是在視神經乳頭處；免疫組化分析表明在健康的小鼠眼內，視神經束和結締組織中BDNF及TrkB的表達相對統一，但是在患有青光眼的小鼠視乳頭處存在神經束的退化，BDNF和TrkB則在剩下的神經束和星形細胞纖維中堆積。通過構建高眼壓小鼠模型和臨床試驗，發現在急性視神經損傷和青光眼的發展和反應過程中，補充BDNF可以成功地延緩急性視神經損傷和青光眼患者的RGC死亡[34]。

6小結

綜上所述，基于青光眼高發病率、高致盲率的特點，青光眼相關信號通路的研究使我們能夠從分子生物和基因水平重新認識青光眼的發病機制，通過定位相關信號傳導通路，探究信號通路中上下游相關蛋白因子，集藥物、手術、視神經的保護和再生于一體，有可能在臨床出現青光眼特征性損害前從分子水平做出更早的臨床前診斷，并為青光眼的診斷和治療提供新的靶點。