重組人生長(zhǎng)激素對(duì)兔角膜損傷早期修復(fù)的研究

張 弛，趙剛平，王 萍，程冬梅，謝 莉

0引言

角膜上皮損傷是世界范圍內(nèi)最常見的角膜疾病之一，角膜炎癥、手術(shù)、外傷、腫瘤等均可造成角膜上皮損傷。角膜上皮損傷修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的過程，與角膜上皮細(xì)胞增殖移行、角膜神經(jīng)再生及炎癥反應(yīng)都有關(guān)系[1]。局部藥物使用是目前公認(rèn)的治療角膜上皮損傷最直接有效的手段，但目前臨床使用的藥物效果不盡如人意。重組人生長(zhǎng)激素(recombinant human growth hormone，rHGH)是一種人工合成的具有人生長(zhǎng)激素功能的蛋白類藥物，可有效促進(jìn)人體其他組織器官的上皮細(xì)胞及外周神經(jīng)纖維的恢復(fù)[2]。關(guān)于角膜上皮損傷修復(fù)的研究發(fā)現(xiàn)，rHGH對(duì)體外人角膜上皮細(xì)胞移行有積極作用，但其對(duì)活體角膜上皮損傷的修復(fù)有無效果尚不清楚。本研究擬采用rHGH作用于角膜上皮損傷兔模型，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討rHGH對(duì)角膜上皮損傷早期修復(fù)的作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)健康雄性成年新西蘭大白兔32只，體質(zhì)量約3kg，均由廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，按標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)。本研究通過動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.1.2主要試劑和儀器重組人生長(zhǎng)激素(美國(guó)洛杉磯生物醫(yī)學(xué)研究所)，戊巴比妥鈉(上海容創(chuàng)生物技術(shù)有限公司)，速眠新(吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司)，鹽酸奧布卡因(日本參天制藥株式會(huì)社)，兔炎癥因子檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Ray Biotech)。手術(shù)顯微鏡(OPMI VARIO 700，德國(guó)蔡司)，角膜環(huán)鉆(直徑8mm，蘇州六六視覺醫(yī)療器械有限公司)。

1.2方法

1.2.1兔角膜上皮損傷模型的建立32只兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1wk后，3%戊巴比妥鈉(1mL/kg)+速眠新(0.3mL/kg)肌肉注射全身麻醉，滴用0.4%鹽酸奧布卡因局部表面麻醉1次，將兔用手術(shù)孔巾包裹置于手術(shù)臺(tái)上，用角膜環(huán)鉆制成雙眼角膜中央直徑8mm的角膜上皮損傷模型。術(shù)后經(jīng)熒光素鈉染色，裂隙燈下觀察，缺損呈圓形，僅去掉上皮，基質(zhì)層完好未損傷，均符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)造模成功后，每只兔子隨機(jī)選取1眼為rHGH組，另1眼即為對(duì)照組。rHGH組滴濃度為20nmol/L的rHGH(生理鹽水做溶劑)，對(duì)照組滴生理鹽水，每2h滴眼1次，每次20μL；夜間22∶00～次日晨8∶00涂妥布霉素眼膏。

1.2.3角膜上皮損傷愈合能力檢測(cè)分別在造模后24、48、72h行雙眼熒光素鈉染色，并在裂隙燈下拍照記錄角膜愈合情況。用Mage J軟件測(cè)量染色面積，并計(jì)算角膜上皮愈合率，角膜上皮愈合率=(0h染色面積-觀察時(shí)染色面積)/0h染色面積×100%。

1.2.4角膜上皮神經(jīng)再生能力檢測(cè)分別在造模后24、48、72h用角膜敏感度測(cè)量計(jì)(Cochet-Bonnet)檢測(cè)中央角膜敏感度，評(píng)估角膜上皮神經(jīng)再生能力。

1.2.5淚液炎癥因子水平檢測(cè)分別在造模后24、48、72h收集淚液，用兔炎癥因子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1α、IL-17α、IL-21、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和Leptin在淚液中的表達(dá)情況。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間多個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析；若存在組間差異性，則采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)比較兩組之間的差異；若存在時(shí)間差異性，則采用LSD-t檢驗(yàn)比較組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的差異。P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 rHGH對(duì)兔角膜上皮損傷愈合的影響造模前后，兩組角膜上皮愈合率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=1862.747，F(xiàn)組間=37.186，F(xiàn)時(shí)間×組間=13.005，均P<0.01)。rHGH組角膜上皮愈合速度比對(duì)照組快，造模后48、72h，兩組角膜上皮愈合率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表1，圖1。

圖1 rHGH對(duì)兔角膜上皮損傷的愈合影響 A：角膜上皮損傷24、48、72h后，對(duì)照組與rHGH組兔角膜熒光素鈉染色面積；B：兔角膜上皮損傷24、48、72h后角膜上皮愈合率。bP<0.01 vs 同組造模前；cP<0.05 vs 對(duì)照組。

表1 兩組角膜上皮愈合率比較

2.2 rHGH對(duì)兔角膜上皮神經(jīng)再生的影響造模前后，兩組中央角膜敏感度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=301.187，P時(shí)間<0.01；F組間=4.175，P組間=0.045；F時(shí)間×組間=5.669，P時(shí)間×組間<0.01)。rHGH組角膜上皮神經(jīng)再生能力比對(duì)照組強(qiáng)，造模后48h，兩組中央角膜敏感度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2，圖2。

表2 兩組中央角膜敏感度比較

圖2 rHGH對(duì)兔中央角膜敏感度的影響 aP<0.05 vs 同組造模前；cP<0.05 vs 對(duì)照組。

2.3 rHGH對(duì)兔淚液炎癥因子水平的影響造模后各時(shí)間點(diǎn)兩組淚液TNF-α和IL-1α表達(dá)均較造模前增加，且造模后24、48h對(duì)照組表達(dá)均高于rHGH組(P<0.05)。造模后24、48h，兩組淚液MMP-9表達(dá)均較造模前增加，且造模后48h對(duì)照組表達(dá)高于rHGH組(均P<0.05)。造模后24、48h兩組淚液IL-21表達(dá)均較造模前增加(P<0.05)。造模后各時(shí)間點(diǎn)兩組淚液IL-17α、Leptin表達(dá)與造模前相比及兩組之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3、4，圖3。

表3 兩組淚液炎癥因子水平比較

圖3 rHGH對(duì)兔淚液炎癥反應(yīng)的影響 A：TNF-α；B：Leptin； C：MMP-9；D：IL-1α；E：IL-17α；F：IL-21。aP<0.05，bP<0.01 vs 同組術(shù)前；cP<0.05，dP<0.01 vs 對(duì)照組。

表4 兩組淚液炎癥因子水平比較重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果

3討論

rHGH是一種人工合成的具有人生長(zhǎng)激素，最先是用于治療成年人和兒童生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)缺乏類疾病[3]。隨后科學(xué)家們?cè)趧?dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)rHGH能激活表皮和上皮細(xì)胞移行，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖[4-5]。隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)人生長(zhǎng)激素(human growth hormone,HGH)對(duì)角膜也有調(diào)控作用，但相關(guān)報(bào)道有限。Ciresi等[6]報(bào)道指端肥大癥患者的角膜厚度較正常人群厚，同時(shí)也觀察到GH缺乏的患者經(jīng)過1a GH治療后，角膜厚度厚于治療前和對(duì)照組。Ding等[7]發(fā)現(xiàn)rHGH可以促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞和角膜成纖維細(xì)胞體外移行，而移行能力依靠完整角膜上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞之間的交互作用。以往研究通常是在大鼠或小鼠模型上進(jìn)行，其與人眼差距較大。但兔眼的解剖結(jié)構(gòu)、生理病理與人眼較為接近，同時(shí)便于損傷模型的建立，是比大鼠或小鼠更為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。同時(shí)因?yàn)榇菩詣?dòng)物體內(nèi)激素狀態(tài)較為復(fù)雜，為了盡量去除對(duì)本研究有干擾的因素，我們所選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為雄性新西蘭兔，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明rHGH對(duì)兔角膜上皮損傷修復(fù)較對(duì)照組有明顯加快促進(jìn)作用。

rHGH除了能促進(jìn)上皮細(xì)胞移行外，對(duì)神經(jīng)修復(fù)也起著重要作用。Gabrielpillai等[8]報(bào)道rHGH有助于內(nèi)耳神經(jīng)退行性變的好轉(zhuǎn)，Wasinski等[9]發(fā)現(xiàn)大腦中的生長(zhǎng)激素信號(hào)調(diào)節(jié)許多生理功能，如認(rèn)知、行為、神經(jīng)內(nèi)分泌變化和新陳代謝，有助于神經(jīng)元的修復(fù)和重建。雖然對(duì)rHGH在全身創(chuàng)口恢復(fù)中作用的研究已有較多，但對(duì)其在角膜損傷恢復(fù)中所扮演的角色卻未見報(bào)道。本研究通過測(cè)量角膜上皮損傷后中央角膜敏感度發(fā)現(xiàn)rHGH有助于角膜神經(jīng)修復(fù)。

我們?cè)谇捌谘芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)角膜屈光手術(shù)后，炎癥反應(yīng)會(huì)不同程度地影響角膜損傷修復(fù)，多種炎癥因子和角膜上皮愈合、角膜神經(jīng)修復(fù)程度有關(guān)[10]。TNF-α是由激活的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等分泌的一類促炎性介質(zhì)，在健康角膜上皮中可檢測(cè)到TNF-α表達(dá)，也發(fā)現(xiàn)從傷口培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞能夠分泌TNF-α。TNF-α被證實(shí)可以刺激纖維連接蛋白誘導(dǎo)角膜上皮細(xì)胞移行和角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖，同時(shí)可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生，調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞層和角膜基質(zhì)層的損傷修復(fù)[11-12]。IL-1α可在角膜上皮中表達(dá)，當(dāng)角膜上皮受損后，IL-1α接觸角膜基質(zhì)細(xì)胞后可以通過自分泌循環(huán)促使角膜基質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1α，對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞起到消極凋亡的作用。這種負(fù)性趨化作用可能對(duì)保持角膜組織重塑起作用[13]。在角結(jié)膜干燥癥患者淚液中，IL-1α的濃度升高，這可能與角膜上皮細(xì)胞損傷或死亡后，使得IL-1α釋放有關(guān)。但是IL-1α在沒有角膜上皮損傷的情況下是不能移行至角膜基質(zhì)層的，除非角膜上皮損傷，角膜上皮屏障功能破壞[14]。MMP-9是明膠酶類的一種，可以降解多種膠原和蛋白，上皮下MMP-9的表達(dá)和基底膜降解有關(guān)，MMP-9可以和一些炎癥因子(如TGF-β、IL-1)相互調(diào)控，能作為潛在的角膜基質(zhì)修復(fù)炎癥介質(zhì)[15]。在角膜損傷后，炎癥反應(yīng)會(huì)上調(diào)和激活MMP-9的表達(dá)，使之參與角膜修復(fù)過程，使得這些炎癥因子被釋放、激活，這些炎癥因子同時(shí)又能造成淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，T細(xì)胞活化，再通過穿孔素、端粒酶、Fas配基的作用或細(xì)胞毒性作用，破壞溶解角結(jié)膜上皮細(xì)胞或促使細(xì)胞凋亡，從而損害眼表結(jié)構(gòu)，引起淚膜不穩(wěn)定，延緩角膜損傷愈合[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，rHGH組在角膜損傷后淚液中IL-1α、TNF-α和MMP-9的表達(dá)均較對(duì)照組低，明顯降低角膜損傷后的炎癥反應(yīng)，有助于角膜上皮的愈合，但具體機(jī)制目前仍不清楚。有研究報(bào)道胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)可能是一個(gè)重要的潛在介質(zhì)。部分研究發(fā)現(xiàn)局部使用IGF-1有助于角膜上皮損傷修復(fù)，這可能與IGF-1促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞移行和角膜神經(jīng)再生有關(guān)[18-19]，其具體聯(lián)系有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，rHGH可以減輕角膜上皮損傷后炎癥反應(yīng)，加速兔角膜上皮損傷愈合和神經(jīng)修復(fù)。