全反式視黃酸對視網膜色素上皮細胞內質網應激反應的誘導作用及途徑

吳 娟，曾駿文，崔冬梅

0引言

年齡相關性黃斑病變(age-related macular degeneration,ARMD)是視網膜黃斑區光感受細胞凋亡導致中央視力缺失的一種眼部疾病。ARMD的光感受器凋亡主要由于視網膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)細胞失去向光感受器提供氧氣和營養，并運走廢物質的功能導致[1]。由于RPE特殊的解剖位置、高代謝活性以及對光感受器外段的吞噬作用，使得RPE尤其容易受到傷害[2-3]。全反式視黃酸(ATRA)是視覺循環中不可缺少的部分，作為視網膜內的一種內源性化合物，ATRA通常通過RDH(如RDH11)還原而被清除，或形成一系列困在RPE溶酶體中的視網膜衍生物[4-6]。ATRA在RPE細胞內的過度積累導致細胞毒性并導致細胞凋亡[7-8]，并在眼底變性疾病的病因中起到作用。以往的研究表明，由ATRA誘導并通過還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶介導的活性氧(ROS)產生參與了光感受器和RPE細胞的變性退化[9]。但關于RPE細胞變性的分子機制仍不清楚。本課題組在之前的研究中已證實ATRA過度累積導致caspase12被激活，caspase12與內質網應激反應(ERS)關系密切，本文通過對ERS進一步研究了ATRA誘導的ARPE-19凋亡的過程。證明ATRA過度累積激活了ERS中PERK-EIF2α-ATF4及IRE1α-XBP1信號途徑，抑制了ATF6信號途徑。我們的發現為視網膜病變中的ATRA毒性提供了新的見解。

1材料和方法

1.1材料ARPE-19細胞(美國ATCC細胞庫)；DMEM/F12培養基(Gibco)；胎牛血清、全反式視黃酸(ATRA)(Sigma)；蛋白印跡檢測系統(merck)；Trizol試劑(Invitrogen)；Brilliant SYBR Green試劑盒(Takara)；引物序列(上海生工科技公司)；抗BIP抗體(CST3177)、抗CHOP抗體(CST2895)、抗GAPDH抗體(CST5174)；cfx96實時聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測系統(Bio-Rad)；Bio-Rad Quantity One成像軟件(Bio-Rad)；酶標儀(日本OLYMPUS公司)；激光共聚焦光譜顯微鏡(Zeiss)。

1.2方法

1.2.1細胞培養本研究不涉及人體或動物實驗，ARPE-19細胞購自美國ATCC細胞庫。ARPE-19細胞在DMEM/F12中常規培養，輔以10% BSA，青-鏈霉素(100μg/mL)。細胞在37℃下含5%二氧化碳的加濕培養箱中培養。每2～3d更換一次培養基。細胞采用含0.25% EDTA的胰蛋白酶于培養箱中消化2min，并以1∶4～1∶6的比例接種于25mm2培養瓶中進行傳代培養。取對數生長期的細胞用于后續實驗。將ATRA溶解于二甲基亞砜(DMSO)中至10μmol/L的儲備濃度。用DMEM/F12稀釋ATRA至工作濃度，在-20℃下冷凍成小份，避免光照。

1.2.2 qRT-PCR檢測取ARPE-19細胞以2.5×105/mL密度接種于6孔板,用不同濃度的ATRA(0、2.5、5、10、20μmol/L)分別處理ARPE-19細胞24h后收集細胞,并按ATRA濃度分為五組，包括對照組(0μmol/L)和四個濃度實驗組，按PureLink RNA mini kit試劑盒的操作說明提取總的RNA，Trizol試劑純化細胞RNA，逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA。qRT-PCR檢測基因表達情況，配制20μL PCR體系，反應條件：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 50s，60℃ 50s，40個循環，GAPDH為內參基因，2-ΔΔCT法計算靶基因的相對表達水平。所有樣本重復檢測3次，取平均值。引物序列由中國上海生工科技公司提供，見表1。

表1 實時定量PCR中引物序列

1.2.3蛋白質印跡分析用不同濃度的ATRA(0、2.5、5、10、15、20μmol/L)處理ARPE-19細胞24h收集細胞。然后用PBS洗滌，并用RIPA裂解緩沖液溶解，然后在4℃以14000r/min離心15min。上清液蛋白采用SDS-PAGE凝膠電泳。轉膜，并在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1h。CHOP(1∶1000)、BIP(1∶1000)一抗孵育,辣根過氧化物酶(HRP)結合山羊抗鼠或山羊抗兔二抗孵育，采用ECL蛋白印跡檢測系統觀察條帶，并使用Bio-Rad Quantity One成像軟件分析條帶。

1.2.4免疫熒光檢測用ATRA(10μmol/L)處理ARPE-19細胞24h收集細胞。在PBS中洗滌3次后，用4%多聚甲醛固定15min，然后在含有1%胎牛血清(BSA)和0.1% Triton X-100的PBS室溫中放置2h，加入CHOP(1∶200)和BIP(1∶400)4℃濕盒內孵育過夜，次日用PBS洗滌3次，每次5min，用抗兔或抗鼠二抗(1∶400)孵育1h。用DAPI(5mg/mL)染色細胞核10min，用PBS洗滌后，抗熒光衰減劑封片，激光共聚焦光譜顯微鏡觀察并拍照，圖片放大倍數1000，拍攝圖片比例尺寸為20μm。

統計學分析：采用統計學軟件SPSS 22.0對數據進行統計學分析，并用GraphPad Prism 7作圖。本研究中測量指標的計量資料經W檢驗呈正態分布，經Levene檢驗方差齊性。對照組與不同濃度實驗組間差異總體比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1 ATRA處理ARPE-19細胞后引起ERSCHOP、BIP為ERS的標志性蛋白。用不同濃度的ATRA(0、2.5、5、10、15、20μmol/L)處理ARPE-19細胞24h后,免疫熒光法檢測結果提示，ATRA誘導了CHOP(圖1A)和BIP(圖1B)的產生。Western blot法檢測蛋白表達結果見圖1C,分析顯示CHOP(圖1D)、BIP(圖1F)蛋白表達隨著ATRA濃度累積而上調；同時CHOP(圖1E)、BIP(圖1G)的mRNA表達也升高。通過3次獨立實驗，檢測的不同組間CHOP蛋白水平比較，差異有統計學意義(F=19.61,P<0.001)，當ATRA濃度在2.5、5、10、15、20μmol/L時，CHOP蛋白的產生較對照組顯著升高，差異有統計學意義(P=0.009、0.003、0.005、<0.001、<0.001);檢測的不同組間BIP蛋白水平比較，差異有統計學意義(F=21.07,P<0.001)，當ATRA濃度在2.5、5、10、15、20μmol/L時，CHOP蛋白的產生較對照組呈濃度依賴性升高，差異有統計學意義(P=0.004、0.039、0.019、0.0019、<0.001)；檢測的不同組間CHOP的mRNA水平比較，差異有統計學意義(F=770.6,P<0.001)，當ATRA濃度在5、10、20μmol/L時，CHOP的mRNA水平較對照組升高，差異均有統計學意義(P<0.001);檢測的不同組間BIP的mRNA水平比較，差異有統計學意義(F=7.49,P<0.001)，當ATRA濃度在2.5μmol/L時，BIP的mRNA水平較對照組下降，差異有統計學意義(P<0.001);當ATRA濃度在5、10μmol/L時，BIP的mRNA水平較對照組上升，差異有統計學意義(P=0.048、<0.001)，見表2。

圖1 ERS蛋白及mRNA表達 A,B：免疫熒光法CHOP和BIP蛋白表達；C:用不同濃度的ATRA處理ARPE-19 24h,CHOP,BIP的蛋白質印跡表達; D,F：與對照組相比，ATRA增加CHOP和BIP蛋白水平；E，G：qRT-PCR檢測隨著ATRA累積，CHOP和BIP的mRNA表達增加。DAPI：2-(4-氨基苯基)-6-吲哚甲酰胺二鹽酸鹽;CON：對照組；aP<0.05，bP<0.001 vs 對照組。

表2 不同濃度ATRA對ERS標志性蛋白CHOP、BIP的蛋白及mRNA表達水平的影響

2.2 ERS三條主要通路反應

2.2.1 PERK-EIF2α-ATF4通路PERK,EIF2α,ATF4為ERS下游PERK-EIF2α-ATF4通路的標志性蛋白，用不同濃度的ATRA(0、2.5、5、10、20μmol/L)處理ARPE-19細胞24h后，PERK(圖2A)，EIF2α(圖2B)、ATF4(圖2C)的mRNA表達水平較對照組上調，差異均有統計學意義(P<0.001),證明ATRA過度累積激活ARPE-19細胞ERS中的PERK-EIF2α-ATF4通路。通過3次獨立實驗，檢測的不同組間PERK的mRNA水平比較，差異有統計學意義(F=26.95,P<0.001)，當ATRA濃度在2.5、5、10、20μmol/L時，PERK的mRNA水平較對照組水平上升，差異均有統計學意義(P<0.001)；檢測的不同組間EIF2α的mRNA水平比較，差異有統計學意義(F=55.06,P<0.001)，當ATRA濃度在2.5、5、10、20μmol/L時，EIF2α的mRNA水平較對照組水平上升，差異均有統計學意義(P<0.001)；檢測的不同組間ATF4的mRNA水平比較，差異有統計學意義(F=140.5,P<0.001)，當ATRA濃度在2.5、5、10、20μmol/L時，ATF4的mRNA水平較對照組水平上升，差異均有統計學意義(P<0.001)，見表3。

圖2 不同濃度的ATRA處理ARPE-19細胞24h,PERK-EIF2α-ATF4通路中PERK,EIF2α,ATF4 mRNA的表達水平

2.2.2 IRE1α-XBP1通路IRE1α,XBP1為ERS下游IRE1α-XBP1通路的標志性蛋白,用不同濃度的ATRA(0、2.5、5、10、20μmol/L)處理ARPE-19細胞24h后，XBP1(圖3A),IRE1α(圖3B)的mRNA水平表達水平較對照組上調，差異均有統計學意義(P<0.001)，證明ATRA過度累積激活ARPE-19細胞ERS中的IRE1α-XBP1通路。通過3次獨立實驗，檢測的不同組間IRE1α的mRNA水平比較，差異有統計學意義(F=43.08,P<0.001)，當ATRA濃度在10、20μmol/L時，IRE1α的mRNA水平較對照組水平上升，差異均有統計學意義(P<0.001)；檢測的不同組間XBP1的mRNA水平比較，差異有統計學意義(F=19.90,P<0.001)，當ATRA濃度在2.5、5、10、20μmol/L時，XBP1的mRNA水平較對照組水平上升，差異均有統計學意義(P<0.001),見表3。

圖3 不同濃度的ATRA處理ARPE-19細胞24h,IRE1α-XBP1通路中IRE1α,XBP1 mRNA表達水平 A：XBP1 mRNA表達水平；B：IRE1α mRNA表達水平。bP<0.001 vs 對照組。

表3 不同濃度ATRA對ERS三條通路標志性蛋白的mRNA表達水平的影響

2.2.3 ATF6通路ATF6為ERS下游ATF6通路的標志性蛋白,用不同濃度的ATRA(0、2.5、5、10、20μmol/L)處理ARPE-19細胞24h后，ATF6的mRNA水平較對照組差異無統計學意義(P=0.36、0.24、0.58、0.61，圖4，表3)，證明ATRA過度累積未激活ARPE-19細胞ERS中的ATF6通路。通過三次獨立實驗，檢測的不同組間ATF6的mRNA水平比較，差異無統計學意義(F=0.74,P>0.05)。

圖4 不同濃度的ATRA處理ARPE-19細胞24h,ATF6通路中ATF6 mRNA表達水平。

3討論

ERS與氧化應激、血管生成和細胞凋亡相關，被認為是ARMD發生發展的關鍵致病機制[10]。ERS和未折疊蛋白反應(UPR)可由ARMD危險因素(如氧化、蛋白質毒性和代謝應激)和細胞因子引起，對視網膜變性疾病的研究證明，在其中RPE細胞中存在錯誤折疊的蛋白質分子[11]。UPR的主要功能是維持正常的內質網功能和保護細胞免受環境損傷[12]，其中大部分和ERS相關的途徑是由BIP調節的[13-14]。BIP是一種重要的內質網伴侶，調節ERS相關通路，并防止錯誤折疊和展開的蛋白質的積累，其表達是由ERS和錯誤折疊的蛋白質觸發的[15-16]。這個重要的內質網伴侶防止錯誤折疊和未折疊蛋白的積累，其表達是由ERS和錯誤折疊蛋白觸發的[17-18]。在我們的研究中，經ATRA處理后的ARPE-19細胞中的BIP表達水平升高，說明ERS參與了這一實驗過程。關于未折疊蛋白反應的信號途徑，ERS傳感器引發的三種途徑(PERK、IRE1α和ATF6)在細胞ERS方面最受關注[19]。大多數數據支持這樣一種觀點，即CHOP是由PERK/EIF2α/ATF4以及IRE1α/XBP1和ATF6亞通路誘導的，從而激活促凋亡基因表達、恢復翻譯起始并增加內腔的氧化電位[20]。CHOP是ERS時ATF4轉錄因子的主要靶點和細胞凋亡的執行者[11]。CHOP的許多轉錄靶點也與介導細胞凋亡有關。其中包括Ero1α、GADD34和BIM。BIM是一個僅BH3結構域的基因，啟動線粒體凋亡途徑，導致線粒體膜電勢(Δψm)下降。任何通過線粒體呼吸鏈的電子傳遞損傷都會導致氧的不完全還原，最終導致ROS的形成[21]。CHOP在ERS期間介導了Ero1α表達的激活，從而加重了應激細胞內質網中ROS的積累[22]。除了PERK介導的UPR外，研究還發現IRE1α有助于ERS應激誘導的細胞死亡[23]。IRE1α有一個RNase結構域，在ERS應激下激活，Oakes等發現IRE1α切割了通常抑制caspase 2合成的microRNA[24]，從而引起caspase 2水平升高，最終導致細胞死亡[25]。也有研究發現在人臍靜脈內皮細胞中當IRE1α途徑被激活，CHOP表達也會自發激活，ROS生成增加，IRE1α抑制劑STF-083010可有效降低CHOP的表達水平及ROS水平[26]。說明PERK及IRE1α介導的UPR均可能誘導CHOP的表達，并進一步導致ROS的積累。在本研究中，ATRA通過PERK-EIF2α-ATF4信號通路和IRE1α-XBP1信號通路激活細胞ERS。隨著ATRA濃度的升高，相關通路的mRNA表達也隨之升高。當以最高劑量孵育時，PERK相關mRNA的表達趨勢會變小，這可能歸因于負反饋回路。PERK激活在數小時內誘導ATF4，并且在不久后誘導ATF4的轉錄靶點，PERK/ATF4信號也具有負反饋環，在1～2d內抑制其活性[27]。先前的研究表明，EIF2α抑制劑Salubrinal，能顯著降低ATRA誘導的RPE細胞凋亡水平[28]，與本文研究結果相符。ATRA介導的活性氧過度產生是ERS誘導的RPE細胞凋亡的早期事件，并且通過抗氧化作用清除活性氧。抗氧化劑可能是一種有效地保護視網膜細胞免受過量ATRA侵害的策略。

盡管ATRA對視力是必不可少的，但這種分子在RPE細胞內的過度積累會導致細胞毒性。本研究從ERS的角度進行闡述，擴大了我們關于ATRA對人RPE細胞毒性的認識，在減輕ATRA對細胞器有害作用的基礎上，為靶向治療開辟了新的途徑。