單眼形覺剝奪性弱視大鼠視皮層突觸密度及功能的研究

李 謙，畢愛玲，張秀艷，張莉唯，路致遠，王興榮，畢宏生

?KEYWORDS:monocular deprivation; visual cortex; synaptic density; synaptophysin; visual function

0引言

弱視是與視皮層突觸發育可塑性相關的一種兒童常見臨床眼病，可以造成多種視功能損害，據統計我國弱視的發病率可高達2%～4%[1]，主要原因是視覺發育關鍵期內由于單眼斜視、屈光參差、高度屈光不正以及形覺剝奪等異常視覺經驗引起的單眼或雙眼最佳矯正視力低于相應年齡正常兒童，且眼部檢查無器質性病變[2]。若治療錯過視覺發育敏感期，則療效較差，嚴重者將造成不可逆的視功能損害，甚至可能造成患兒視力喪失[3]。因此深入研究弱視的發病機制對于疾病的治療有著重要意義。已有研究證明，學習記憶過程中大腦皮層存在突觸可塑性的改變[4-5],而視皮層發育過程與學習記憶過程具有相似的分子生物學機制，需要突觸可塑性。近年來研究發現，在視覺發育過程中存在著大量的神經元突觸聯系，弱視的發生發展與視皮層突觸結構的功能性密切相關，其中結構的可塑性主要表現在視皮層突觸密度超微形態變化上，要了解神經元回路如何調控大腦視皮層突觸功能可塑性，需要對神經元突觸進行超微結構分析。突觸素(synaptophysin，SYN)是最豐富的突觸囊泡膜蛋白，在突觸形成修飾、信息傳遞、生長發育、學習記憶等方面發揮著重要調控作用，常用于突觸前終末端的標記[6]。目前,借助免疫熒光組織化學技術，SYN突觸蛋白已在動物及人類中被廣泛用于評估突觸數量及神經終末密度,可以客觀地呈現突觸數或突觸前終末密度的變化。已有研究發現在視皮層早期發育和成熟中SYN突觸蛋白發揮著重要作用，并可能參與視覺發育敏感期視皮層突觸可塑性的調控[7]。但突觸素影響視皮層突觸可塑性的機制尚不明確。本研究在建立單眼剝奪性弱視模型Long Evans大鼠的基礎上，重點探討視覺發育關鍵期形覺剝奪對大鼠視皮層突觸密度和超微形態結構變化規律的影響，以及SYN在視皮層的表達及意義，研究弱視大鼠視皮層突觸密度及功能與突觸可塑性的關系，為弱視治療的分子機制探索提供新的思路。

1材料和方法

1.1材料將成年的SPF級Long Evans大鼠進行合籠，約30d娩出幼鼠，常規檢查雙眼，排除眼部器質性疾病。隨機選取剛出生的幼鼠50只。成年動物均購自北京維通利華動物技術有限公司，飼養溫度保持25℃左右，控制12h/12h的晝夜光照規律，食物水源充足，自由飲食。實驗動物的飼養過程得到山東中醫藥大學實驗室動物管理和使用委員會的批準，且實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》和山東中醫藥大學倫理委員會的標準。主要儀器及試劑：手術器械，冰凍切片機(德國SLEE)，熒光顯微鏡(日本Olympus)，激光共聚焦顯微鏡(Zeiss)，透射電子顯微鏡(JEM-1200，日本)；英國OPTOPROBE電生理儀；數碼相機(OSIS，德國)；腦切片模具(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)等。一抗SYN抗體[YE269] (ab32127，Abcam,英國)，二抗Alexa Fluor488(Invitrogen，美國)，紅霉素眼膏(北京雙吉制藥有限公司)；氧氟沙星滴眼液[辰欣偉都藥業(汶上)有限公司]等。

1.2方法

1.2.1大鼠單眼剝奪性弱視模型的建立參照文獻[8-9]建立單眼形覺剝奪(MD)經典弱視模型,在大鼠出生后13d，眼睛未睜開時，將大鼠進行麻醉固定，并對右眼進行表面麻醉，用顯微剪剪去眼瞼處的毛發，并用生理鹽水和乙醇清洗消毒眼瞼周圍皮膚，剪去距離上下眼瞼緣約0.8～1.2mm處的皮膚和組織后，用眼科縫合線對右側眼瞼進行2～4針的間斷縫合。術后7d內，每日早中晚各一次使用氧氟沙星滴眼液及紅霉素眼膏，并及時對創口愈合情況進行檢查。若出現脫線、漏光、眼內感染的動物，將予以剔除，不再納入后續實驗。最終納入實驗大鼠共32只，每組16只。兩組大鼠均在標準條件下飼養至21d，然后剪開縫合的眼瞼，1mo后行閃光視覺誘發電位(F-VEP)檢測。

1.2.2 F-VEP檢查檢查參照ISCEV標準，將大鼠提前置于暗室內，使其暗適應12h后給予1%戊巴比妥鈉溶液腹腔麻醉。電極位置: 正極為大腦枕葉對應皮下,負極為臉頰,接地為尾部皮下, 隨后按照電生理儀操作系統進行操作。用閃爍光作為刺激光，刺激頻率1Hz，通頻帶寬0.5～85.0Hz，分析時間250ms，疊加60次，連續測量至少3次，記錄P2波振幅和潛伏期。

1.2.3電鏡檢測大鼠視皮層神經元突觸超微結構F-VEP檢測結束后取材，將兩組Long Evans大鼠快速斷頭，取腦并放在腦切片模具中，采用前囟標記法(以確保每只動物取材位置相同)，根據大鼠腦立體定位圖譜[10]切取雙側視皮層腦組織，垂直該冠狀面切取V1M區(單眼投射區)內長3mm,橫截面約1.5mm2長條(含初級視皮層的全層)，放于盛有戊二醛溶液的EP管中。經前固定、洗凈、后固定、乙醇梯度脫水、氧化丙烯浸透、60%環氧樹脂氧化丙烯浸透、100%環氧樹脂包埋、組織切片、超薄切片，鉛鈾染色制成樣本。利用透射電鏡對兩組大鼠的初級視皮層V1M區第Ⅳ～Ⅵ層大錐體細胞周圍神經纖維網絡隨機拍攝(1萬倍下每個樣本拍攝10張視野，每張視野都大于2500μm2，且每張視野都不重復)。利用Image J軟件進行突觸的標記測量。并通過經典突觸密度統計方法(NA/d法)計算突觸密度[11-12]。即突觸密度=NA/d。NA表示單位面積上的突觸數目；d為突觸橫斷面的長度。

1.2.4免疫熒光檢測大鼠視皮層中SYN的表達F-VEP檢測結束后取材，常規使用戊巴比妥鈉溶液麻醉動物，將兩組大鼠灌流取腦，4%多聚甲醛后固定，30%蔗糖脫水沉底。將沉底后的大鼠腦組織從蔗糖溶液中取出，-20℃的環境中進行冰凍包埋，做連續的冠狀位切片，厚度為40μm。在冠狀位切片時注意邊切片邊觀察，依據視皮層出現的解剖學位置(可以在胼胝體分開后)開始收片。將切好的腦片放至裝有防凍液的EP管中，放入冰箱-20℃保存。利用漂染法對視皮層冰凍切片進行免疫熒光組織化學染色，將腦片從EP管中取出放到TBS溶液中靜置10min恢復室溫，再用TBS溶液清洗3～5次，每次10min,主要洗去黏著在腦片的防凍液。用0.3% triton-X100,10%山羊血清作為封閉液，室溫封閉1h，封閉非特異性抗原。按濃度為1∶1000加入一抗SYN抗體室溫孵育1h后，再放入4℃過夜再孵育。用相同濃度的PBS溶液代替一抗作為陰性對照，可以排除非特異染色的影響。第2d取出用TBS溶液清洗3～5次，每次15min。再加入與一抗相對應的二抗Alexa Fluor488室溫下避光孵育2h。清洗，晾干，貼片，滴加防熒光淬滅劑，蓋上蓋玻片，指甲油封片，晾干，在激光共聚焦顯微鏡及熒光顯微鏡下進行定位觀察和定量統計分析。此外，根據《大鼠腦立體定位圖譜》[10]選取左側視皮層組織區域在熒光顯微鏡下進行拍照,免疫熒光染色的每張切片在高倍鏡下隨機選取3個不重復視野,通過尼康NIS-Elements AR圖像處理軟件系統計算每張切片SYN陽性區域面積的強度值。

2結果

2.1兩組大鼠F-VEP檢查結果兩組大鼠F-VEP檢查結果示，與正常對照組相比，弱視模型組剝奪眼的P2潛伏期較正常眼明顯延長，P2波振幅較正常眼明顯降低，差異均具有統計學意義(P<0.05，圖1，表1)，說明弱視造模成功。

圖1 兩組大鼠F-VEP檢查結果 A:正常對照組；B:弱視模型組。

表1 兩組大鼠F-VEP檢查結果

2.2兩組大鼠視皮層V1M區突觸密度的變化利用Image J軟件觀察并統計兩組大鼠雙側視皮層的突觸密度，結果發現與正常對照組雙側視皮層相比，弱視模型組雙側視皮層的突觸密度顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，其中弱視眼對側視皮層下降更加明顯(表2，圖2)。

表2 兩組大鼠視皮層V1M區突觸密度的變化 個/μm3)

圖2 兩組大鼠雙側視皮層突觸電鏡圖 A：正常對照組右側視皮層；B：正常對照組左側視皮層；C：弱視模型組右側視皮層；D：弱視模型組左側視皮層。紅色箭頭所指即為突觸。

2.3兩組大鼠視皮層中SYN的表達情況本實驗根據《大鼠腦立體定位圖譜》[10]選取左側視皮層(剝奪眼對側)組織區域，利用熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡對視皮層切片進行拍照處理。共聚焦顯微鏡下兩組大鼠視皮層區域組織結構清晰、無皺褶，染色清晰，未見非特異性染色，均可見SYN陽性表達，與正常對照組相比，弱視模型組視皮層SYN陽性神經元表達更弱。在熒光顯微鏡下進行拍照,統計每張切片SYN陽性區域面積的強度值。結果發現，與正常對照組左側視皮層(0.281±0.008)相比，弱視模型組剝奪眼對側視皮層(0.137±0.011)的SYN陽性神經元表達強度值明顯降低，差異具有統計學意義(t=10.494，P<0.01,圖3)。

圖3 共聚焦顯微鏡下兩組大鼠視皮層區域組織結構 A：正常對照組左側視皮層；B：弱視模型組剝奪眼對側視皮層。

3討論

F-VEP是一種檢測視網膜到視皮層傳導通路的客觀測量方法，它可以檢測視覺通路病變，評估視覺傳導功能，在弱視模型基礎研究中應用廣泛[13-14]。李蘭等[15]在單眼形覺剝奪小鼠的基礎上同時研究小鼠F-VEP和初級視皮層V1區長時程增強(long-term potentiation，LTP)的變化，發現弱視小鼠的視皮層V1區LTP受損，正常組對應的視皮層V1區可成功誘導LTP，說明形覺剝奪眼對應的視皮層V1區LTP受損，突觸可塑性降低，從電生理角度促進了弱視發生的視皮層突觸可塑性機制研究。哺乳動物皮層的興奮性突觸傳遞主要發生在樹突棘的頭部，而在視覺皮層中，約有95%的樹突棘形成突觸。本實驗以單眼形覺剝奪大鼠為弱視模型,采用電生理方法探討形覺剝奪后F-VEP的變化規律，對反映視皮層突觸強度的客觀視功能進行評估。結果發現，與正常對照組相比，弱視模型組剝奪眼的P2波潛伏期較正常眼明顯延長，P2波振幅較正常眼明顯降低。根據之前相關研究推測，單眼剝奪可能導致了樹突棘形態和密度的改變[16-17]。在單眼剝奪后，剝奪眼接受的視覺刺激減弱，導致視覺通路突觸神經元樹突棘形態和密度的變化，進而引起突觸傳遞速度緩慢，最終在F-VEP上表現為P波潛伏期延長，振幅下降，從而可以作為驗證弱視造模成功的有效手段。

哺乳動物在出生后的一段時期內,其視覺系統的視皮層神經元聯系及突觸結構會隨著視覺經驗的變化而發生改變，表現出與改變相對應的可塑性，稱為視皮層突觸可塑性，這段時期是視覺發育的關鍵期[18]。Hubel等[19]研究單眼形覺剝奪對貓視覺皮層功能的影響，發現了視皮層具有經驗依賴可塑性。在視皮層發育關鍵期，視覺經驗的改變可以造成視皮層突觸可塑性的變化，在微觀水平上則表現為視皮層神經元突觸結構和功能的改變。突觸是神經元之間信息傳遞的基本單位,是視皮層神經元結構與功能發育的重要基礎，也是視覺發育可塑性的關鍵結構。視覺發育關鍵期視皮層突觸結構存在功能可塑性。弱視的發生、發展與視皮層發育及突觸可塑性密切相關。因此對視皮層神經元超微結構變化的研究可以更好地揭示單眼形覺剝奪性弱視的發病機制。本實驗采取突觸結構經典的特征性參數突觸密度來觀察和研究視皮層突觸的超微結構。結果發現弱視模型組雙側視皮層的突觸密度比正常對照組顯著降低，且弱視剝奪眼對側視皮層下降更加明顯。表明單眼剝奪可以阻斷視覺發育關鍵期內視皮層神經元之間的突觸傳遞及功能聯系，這可能是導致突觸結構改變的病理基礎。在視覺發育的關鍵期，視皮層存在著突觸修剪的過程[20-21]，有序的修剪使雙眼的投射纖維在視皮層的投射更加精準。我們推測單眼剝奪可能導致突觸修剪紊亂，從而造成突觸密度的下降。

SYN突觸蛋白位于突觸前末梢，是一種重要的突觸標志物，在促進突觸發育和調節可塑性中具有重要作用[22-23]，參與了視覺發育過程中視皮層神經元突觸可塑性的形成和成熟。本實驗以Long Evans大鼠為研究對象，建立MD弱視經典模型。Long Evans大鼠視覺系統神經元的雙眼視覺較好，視網膜色素上皮層更接近人的視網膜生理結構，在視覺神經科學方面的研究具有較好的優點，被廣泛應用于眼科學研究。在視覺傳導過程中，由于視覺神經元在視交叉處存在交叉投射，大鼠視皮層接受的信號大多來源于對側眼，這就造成剝奪眼對側視中樞所產生的剝奪效應遠大于剝奪同側[24]。因此比較兩組大鼠左側視皮層SYN突觸蛋白表達變化意義更大。結果發現：與正常對照組左側視皮層相比，弱視模型組左側視皮層的SYN陽性神經元表達強度值明顯降低。本研究中突觸蛋白水平的下降可能與單眼形覺剝奪后突觸結構和功能損傷有關，異常的視覺刺激誘發了視皮層可塑性的顯著變化。根據之前相關研究[25]及本實驗結果推測可能是單眼形覺剝奪導致神經突觸前末梢軸突減少而導致SYN表達量減少。另一方面可能是異常的視覺經驗影響了視網膜-外側膝狀體-初級視皮層視覺傳導通路，導致突觸神經元之間的聯系減少，從而引起視覺中樞視皮層SYN的表達量減少。

總之，采用F-VEP檢測成功驗證了弱視模型的建立，對反映視皮層突觸強度的客觀視功能進行評估，從電生理學角度進一步研究單眼剝奪對視皮層突觸功能的影響；利用透射電子顯微鏡，展示了視覺發育關鍵期突觸結構的變化規律，即MD弱視可造成視皮層突觸密度的改變，從視皮層突觸密度超微形態結構角度來解釋弱視的發病機制。此外，我們發現SYN突觸蛋白在視皮層突觸可塑性調控中的作用是必要的，推測SYN影響視覺發育關鍵期視皮層突觸結構與功能，這可能是弱視發病的重要分子機制之一。對于單眼形覺剝奪是如何通過調控視皮層神經元宏觀突觸功能與微觀突觸結構變化來影響弱視的發生、發展，未來值得探索。