抗疏強骨顆粒對去卵巢模型大鼠血清ALP 及TRACP5b 的影響?

陳丹丹，董 博，歐國峰，王國柱，肖 斌，陳 瑞，袁普衛，方 晴

1 陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；2 陜西中醫藥大學附屬醫院；3 陜西中醫藥大學第二附屬醫院

骨質疏松癥是一種全身性代謝性疾病，主要表現為骨量低下或骨微觀結構改變，進而引起骨脆性和骨折風險增加［1］。據不完全統計，目前世界上原發性骨質疏松癥患者已超過2 億，世界衛生組織將其列為老年人三大疾病之一［2］。本病屬祖國醫學“骨痿”“骨痹”等范疇，雖然其病因和發病機制尚未完全闡明，但中醫藥治療具有明顯優勢［3-5］。抗疏強骨顆粒是陜西中醫藥大學第二附屬醫院院內制劑，在治療原發性骨質疏松癥方面取得了良好效果［6］。本研究旨在觀察抗疏強骨顆粒對去卵巢模型大鼠血清堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和人抗酒石酸酸性磷酸酶5b（tartrate resistant acid phosphatase 5b，TRACP5b）的影響，探討其作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選用6 月齡清潔級未懷孕雌性大鼠100 只，體質量約（200±50）g，由西安交通大學醫學部實驗動物中心提供，檢疫符合實驗研究標準，生產許可證號：SCXK（陜）2017-003。

1.2 實驗藥物抗疏強骨顆粒由陜西中醫藥大學第二附屬醫院中草藥房提供，藥物組成：黃芪30 g，熟地黃15 g，淫羊藿15 g，肉蓯蓉15 g，菟絲子15 g，當歸12 g，丹參12 g，三七6 g，延胡索15 g，白芍12 g，骨碎補15 g，牛膝15 g，甘草10 g，1 g干浸中藥粉末相當于2.83 g生藥。

1.3 實驗主要試劑與儀器ALP 試劑盒（批號：

AR0019）、TRACP5b 試劑盒（批號：ST1021）均由陜西博達生物科技有限公司提供；蘇木素染液（批號：ST047）；伊紅染液（批號：G1120）均由北京索萊寶科技有限公司提供；固定板、手術器械、離心管、移液槍、EP 管等；2135 型石蠟切片機（德國萊卡）；DM400B生物顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.4 方法

1.4.1 造模方法 除正常組外，其他組大鼠適應性喂養1 周后開始造模，造模前將大鼠禁食、禁水24 h，10%水合氯醛（0.15 mL/100 g）腹腔內注射麻醉，待大鼠進入睡眠狀態（麻醉滿意）后俯臥固定，剔除腰脊背部兩側毛發，用濕紗布擦拭，手術部位擦干凈后進行局部消毒，沿腰椎左側切開1 cm 皮膚，取出筋膜，分離肌肉后可見腎臟外下方呈淡粉色的卵巢及緊密相連的子宮角，在子宮上端及下部輸卵管部位結扎［7］，切斷子宮角，摘除卵巢并稱重，用同樣的方法切除右側卵巢，清洗后依次逐層關閉切口，齒鑷對皮后縫合皮膚，傷口涂抹紅霉素并用消毒紗布包扎。術后臀肌注射青霉素（40 萬IU/kg）7天，每天1次，預防感染。該“切除雙側卵巢”造模方法于1969年由Saville最先建立，經過長期反復實驗驗證，具有可靠性，國內外應用廣泛［8］。飼養90 天后造模組大鼠出現反應遲鈍、精神不振等癥狀，骨組織病理切片示出現骨質疏松病理改變，提示造模成功。

1.4.2 分組及給藥 根據隨機數字表法將造模后的大鼠分為模型組和中藥（大、中、小劑量）組，另設未造模正常組，每組20 只分籠飼養，予抗生素常規喂養7日后開始給藥，中藥大、中、小劑量組按照相應劑量灌胃給藥（2.865、1.432、0.714 mg/kg）抗疏強骨顆粒，均分別制成2 mL 溶液灌胃），每日1 次，每周6 次，連續給藥3 個月，正常組和模型組正常飼養不給藥。為計量準確，灌胃期間，每2 周用電子天枰稱體質量1次。

1.4.3 標本采集 正常組正常飼養2 周、模型組于造模成功后處死取材。其余各組在完成3 個月灌胃給藥后，10%水合氯醛（0.15 mL/100 g）腹腔內注射麻醉（取材前1 天需禁食24 h），待麻醉滿意后腹部備皮消毒。1）取血：沿腹部中線切開至腹腔，拔開腸管在腹腔后壁可見腹主動脈，用采血針穿刺腹主動脈將血標本采集在負壓采血管中3 mL，拔除采血管。將血液離心后取上清液，離心半徑10 cm，3000 r/min，離心20 min，放入無菌EP 管置于-80℃冰箱保存備用。2）骨組織切片取材：取大鼠右側股骨去除肌肉和筋膜，保留骨膜部分，取出股骨遠端，置于10%福爾馬林溶液中固定24 h，然后置于10%脫鈣液中，脫鈣液每天更新，直到可以用大頭針輕輕刺入，大約用時3周。

1.4.4 觀察指標 觀察正常組、模型組和中藥（大、中、小劑量）組給藥前后大鼠一般情況（包括體質量、精神狀態、毛發顏色和光澤等）；使用ElISA 方法檢測大鼠血清ALP 和TRACP5b，繪制相關曲線以確定其含量；將脫鈣后的股骨標本常規包埋并用HE 染色觀察鏡下骨小梁結構及骨細胞和骨髓脂肪細胞的形態。

1.5 統計學方法應用SPSS 19.0 統計軟件分析數據，計量資料以表示，采用單因素方差分析，組間多重比較方差齊用LSD-t檢驗，方差不齊用Tambane's T2 法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況正常組大鼠除體質量增加外，其他（精神狀況、毛發顏色和光澤等）無明顯異常；手術當天，所有造模大鼠精神較差，活動較少，術后第4 天精神狀態和活動基本恢復正常，能夠正常飲水和進食。造模組大鼠造模90 天后精神狀況較差，毛發顏色晦暗無光澤，體質量下降顯著，偶有毛發脫落等；給予相應劑量藥物灌胃后大鼠精神狀況尚可，毛發色澤較正常組稍差，體質量輕微下降，整體接近正常組大鼠狀態。

2.2 各組大鼠股骨病理切片正常組大鼠細胞結構清晰，大小、形態正常；模型組軟骨細胞顯示有空骨陷窩，細胞核聚縮，且排列不整齊，骨小梁內骨細胞明顯減少；中藥（大、中、小劑量）組軟骨細胞排列規則，結構完整，空骨陷窩罕見，接近正常組。見圖1。

圖1 各組動物骨組織HE染色結果（×40）

2.3 血清ALP 及TRACP5b 含量與正常組比較，模型組血清ALP及TRACP5b含量上升，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥大、中、小劑量組血清ALP及TRACP5b含量下降，中劑量組含量最低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清ALP及TRACP5b含量（)

表1 各組大鼠血清ALP及TRACP5b含量（)

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與中藥中劑量組比較，P＜0.05

3 討論

骨質疏松癥是一種全身性骨病，系因各種原因導致骨量減少或骨微結構改變，最終因骨骼變脆易于發生骨折［9-10］。有研究［10］表明絕經后骨質疏松的發生與體內雌激素分泌水平有密切聯系，雌激素對骨代謝具有調節作用。祖國醫學認為人體是一個有機整體，五臟六腑、氣血陰陽之間相互作用和影響，腎主骨，腎精不足則骨髓不滿，故從腎論治各醫家達到共識［11-13］。肝腎同源，主疏泄，主藏血，兩者之間互相轉化，若肝失疏泄，血與精津液生產及運行受到影響，骨不得充，筋骨不堅，引起疼痛［14-15］。陜西省名中醫劉德玉教授認為骨瘺（骨質疏松癥）是因人素體虛弱，臟腑虛衰，耗損正氣，以致肝腎虧虛為本，正氣不足，無力生血行血，血行不暢，筋骨經脈不得濡養，導致骨質疏松性骨折，肝腎不足是基礎，以補益肝腎為治療大法。“抗疏強骨顆粒”以黃芪、熟地黃為君，益氣助陽、補肝益腎；仙靈脾、肉蓯蓉、菟絲子補腎健脾，強筋健骨；當歸、丹參、三七活血化瘀補血；延胡索、白芍活血止痛；骨碎補、牛膝補肝腎強筋骨；甘草益氣止痛，調和諸藥。組方立法嚴謹，既不忘補肝腎強筋骨，同時兼活血化瘀止痛，標本兼治，正中病因病機。

TRACP5b 是破骨細胞分泌的糖基化蛋白酶，是人體骨吸收的敏感指標。人體血清中存在TRACPa、TRACPb 兩種類型，且二者含量相近，來源不同，在唾液酶作用下二者可相互轉化。來源于巨噬細胞的TRACPa 無酶活性，破骨細胞分泌的TRACPb 具有酶活性，且不受肝腎代謝影響，晝夜數值較穩定，具有廣泛的應用性。SALMINEN 等［16］通過臨床觀察發現TRACPb 是一個敏感度高、可靠性強的骨吸收檢測指標。向青等［17］對大量正常及骨質疏松患者臨床研究發現其血清TRACPb水平不同程度升高，證實TRACPb 是一個較好的骨吸收指標，可在一定程度上代替骨密度儀作為反映骨丟失速率的重要指標。堿性磷酸酶ALP 是反應骨轉換的常用指標，其在人體中分布廣泛，血清ALP 主要來源于骨組織與肝臟。相關研究［18-20］表明堿性磷酸酶與骨礦物質化密切相關，堿性磷酸酶水平可反映成骨細胞活性，是目前評估人體骨礦化障礙的最佳指標。本實驗選取大鼠作為實驗動物，具有價格低廉，喂養方便，與人體解剖結構相似，更易建立骨代謝與吸收平衡等一系列優點，采用切除大鼠雙側卵巢這一經典造模方法，模擬人絕經后雌激素下降狀態，采用HE 染色觀察造模成功與否以及其骨組織病理學改變，通過TRACP5b、ALP水平檢測骨代謝情況，進一步探討中藥抗疏強骨顆粒治療作用與TRACP5b、ALP的相關性，為骨質疏松的中醫藥防治提供一定的實驗基礎。

本研究結果表明，絕經后骨質疏松大鼠血清TRACP5b、ALP 上升，其原因可能與骨質疏松的病因有關，抗疏強骨顆粒能降低去卵巢模型大鼠血清TRACP5b、ALP 含量，其中中劑量效果最顯著。由此得知抗疏強骨顆粒通過降低去卵巢模型大鼠血清ALP、TRACP5b 水平，降低破骨細胞活性，抑制骨吸收，從而治療絕經后骨質疏松癥。