離體肝臟雙泵雙氧合機械灌注設(shè)備應(yīng)用于豬肝臟常溫機械灌注的可行性研究

鄺偉鍵，譚曉宇，何錫然，劉華敏，張 琳，郭家钘，陳素平，霍 楓*

（1.廣東順德工業(yè)設(shè)計研究院（廣東順德創(chuàng)新設(shè)計研究院）生物醫(yī)學(xué)部，廣東佛山528311；2.南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院肝膽外科，廣州510010；3.廣東丁沃生醫(yī)療器械有限公司研發(fā)部，廣東佛山528311）

0 引言

肝移植是目前治療終末期肝病的最有效方法。隨著我國醫(yī)療水平的不斷提升，肝移植手術(shù)成功率大幅度提高。但合格供肝數(shù)量的短缺制約了我國肝移植事業(yè)的發(fā)展[1]。同時臨床上有大量的邊緣性供肝因保存或其他原因達不到移植標準而被廢棄[2]。因此，改善邊緣性供肝質(zhì)量、保持供肝活性是擴大供肝源的重要途徑。

肝臟的機械灌注最早由Starzl等[3]于1968年提出，但受限于當(dāng)時的機械設(shè)備性能以及細菌感染的風(fēng)險，價格低廉、操作簡便的靜態(tài)冷保存比機械灌注表現(xiàn)更為優(yōu)越[4]，因此臨床上一直沿用靜態(tài)冷保存長達30 a之久。目前由于供肝需求量日益增大，臨床上被迫開始使用更多的邊緣性供肝，此時機械灌注再次成為肝臟保存的研究熱點。相關(guān)研究表明[5-6]，常溫機械灌注對供肝的損傷能減少50%，供肝平均保存期增加54%，器官棄用率降低50%。目前國外已經(jīng)研發(fā)了數(shù)個常溫灌注設(shè)備并逐漸投入臨床使用[7]，而我國在相關(guān)領(lǐng)域的研究處于空白狀態(tài)，因此發(fā)展國內(nèi)的離體肝臟常溫機械灌注設(shè)備已經(jīng)迫在眉睫。由廣東順德工業(yè)設(shè)計研究院、南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院以及廣東丁沃生醫(yī)療器械有限公司聯(lián)合研發(fā)的DEVOCEAN-LIVER 2000是國內(nèi)首創(chuàng)的雙泵雙氧合器的肝臟體外灌注設(shè)備，同時具備常溫機械灌注與低溫機械灌注功能。為驗證該設(shè)備常溫機械灌注的可操作性、安全性以及有效性，本研究采用該設(shè)備對豬肝臟開展肝臟離體常溫機械灌注實驗，驗證其對肝臟體外保存的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雌性巴馬小型豬6只，均由東莞松山湖實驗動物科技有限公司提供，體質(zhì)量范圍45~50 kg。手術(shù)前12 h禁食、禁水。

1.2 供肝獲取及修整

首先給實驗豬肌肉注射混合藥物（100 mg舒泰+5 mg咪達唑侖）進行基礎(chǔ)麻醉后，采用留置針建立耳緣靜脈通路，然后靜脈注射2 mg/（kg·h）丙泊酚維持深度麻醉，隨后進行氣管插管及呼吸機供氧。麻醉穩(wěn)定后，對實驗豬進行腹中線開腹手術(shù)，術(shù)野上至劍突，下至最后一對乳頭。充分暴露腹腔，游離腹主動脈、下腔靜脈及門靜脈。游離完畢后，在耳緣靜脈注射25 000 U肝素。待肝素作用2 min后于下腔靜脈置管，收集血液約1.5 L用于后續(xù)制作灌注液。

血液收集完畢后，打開胸腔，結(jié)扎胸主動脈。用1 L 4℃的高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液（HC-A液體，上海輸血技術(shù)有限公司）經(jīng)腹主動脈與門靜脈進行在體灌注，此時記錄為熱缺血完畢，開始進入冷缺血階段。灌注完畢后，在保留含肝固有動脈的腹主動脈情況下，快速將肝臟從機體分離。將供肝置于含生理鹽水的冰盆中進行修整，置入動脈與門靜脈插管。肝臟熱缺血控制在11 min，冷缺血控制在80 min。

1.3 灌注液制備

手術(shù)收集的實驗豬自體血液過濾白細胞后，加入羥乙基淀粉40氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司）擴容至2 L，使紅細胞比容（HCT）維持在28%~35%，并加入10 g白蛋白（美國杰特貝林生物制品有限公司）、12 500 U肝素（天津生物化學(xué)制藥有限公司）以及1 g頭孢西丁（安徽省咸豐制藥有限公司）后便可作為常溫機械灌注的灌注液。

1.4 灌注方法

采用DEVOCEAN-LIVER 2000[8]進行常溫機械灌注。具體方法：加入灌注液，排清管路空氣，并等待灌注液充分氧合。隨后將肝臟放置于儲肝器之中，將門靜脈插管和動脈插管分別與DEVOCEAN-LIVER 2000連接，此時記錄為冷缺血完畢，進入常溫機械灌注階段。將計算機與壓力傳感器、流量傳感器連接，實時記錄灌注液的血流動力學(xué)數(shù)據(jù)。灌注模式為恒壓模式，灌注溫度為37℃，動脈灌注壓維持在60~80 mmHg（1 mmHg=133.32 Pa），門靜脈灌注壓控制在6~8 mmHg，共灌注6 h。

1.5 樣本收集及指標檢測

機械灌注開始10 min后（記為灌注0 h），使用雅培iSTAT-300G血氣分析儀對每小時的灌注液進行分析，同時利用微納芯Pointcare V2對灌注液進行生化檢測。分別取灌注前以及灌注終末時的肝臟組織用10%福爾馬林固定，進行HE染色后在顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，并采用兩獨立樣本均數(shù)t檢驗進行比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血流動力學(xué)

動脈流量及門靜脈流量變化如圖1所示。由圖1可見，灌注液的流量隨著灌注時間平穩(wěn)增長。灌注1 h時動脈流量為（0.10±0.06）mL/[min·g（肝重）]，門靜脈流量為（0.61±0.36）mL/[min·g（肝重）]；灌注6 h時動脈流量為（0.19±0.11）mL/[min·g（肝重）]，門靜脈流量為（0.81±0.39）mL/[min·g（肝重）]。灌注1 h與灌注6 h的動脈流量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.15），灌注1 h與灌注6 h的門靜脈流量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.32）。動脈血液pH值一直維持在7.2~7.5，灌注0 h與灌注6 h的pH值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.263），如圖2所示。

圖1 灌注液流量變化

圖2 動脈血液p H值變化

2.2 肝功能

2.2.1 膽汁生成量

肝臟連接灌注設(shè)備以后，不同肝臟產(chǎn)生膽汁的起始時間不同，但均在前1 h內(nèi)開始形成，隨后每小時都有膽汁生成，最高峰時可達0.008 5 mL/[h·g（肝重）]。但由于缺乏膽鹽，膽汁生成曲線會呈現(xiàn)倒“V”形，如圖3所示。

2.2.2 轉(zhuǎn)氨酶水平

如圖4、5所示，在灌注初期谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）與谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）均有較大漲幅[ALT達（48.11±35.05）U/L，AST達（315.67±275.97）U/L]，隨后的灌注過程中，ALT、AST雖有漲幅，但整體趨于平穩(wěn)。灌注前ALT為（25.29±9.25）U/L，灌注6 h后為（63.14±43.69）U/L（P=0.05）。灌注前AST為（30.85±9.17）U/L，灌注6 h后為（740.00±281.98）U/L（P=0.00＜0.05）。

圖3 灌注期間膽汁生成量變化

圖4 灌注液ALT變化

圖5 灌注液AST變化

2.2.3 血糖及乳酸濃度

灌注期間血糖變化如圖6所示，灌注前血糖為（16.62±4.97）mmol/L，灌注6 h后為（11.55±3.26）mmol/L（P=0.09），總體呈現(xiàn)平穩(wěn)下降趨勢。血液中乳酸的變化如圖7所示，灌注前為（3.23±0.43）mmol/L，灌注6 h后下降至（0.96±0.38）mmol/L，灌注前與灌注6 h的乳酸水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2.4 總膽紅素

灌注期間血液中總膽紅素的變化如圖8所示。灌注前總膽紅素為（4.04±0.40）μmol/L，灌注結(jié)束時為（5.39±4.88）μmol/L。灌注前后膽紅素變化不明顯（P=0.50）。

2.3 組織形態(tài)學(xué)

如圖9所示，肝臟經(jīng)歷一段時間的缺血后，大部分區(qū)域呈深紅色，顏色并不均一，可見明顯的瘀斑，邊緣無增厚，表面光滑。經(jīng)DEVOCEAN-LIVER 2000灌注6 h后肝臟外觀如圖10所示，肝臟體積無增大或縮小，外形無明顯改變，瘀斑消失，肝門區(qū)域輕微腫脹。肝臟病理切片如圖11所示，灌注前肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，無淤血；灌注結(jié)束后小葉結(jié)構(gòu)仍然保持完整，肝竇輕微擴張伴有輕微淤血，肝實質(zhì)細胞輕微水腫，可見少量灶狀壞死。肝臟灌注前后細胞結(jié)構(gòu)變化不明顯。

圖6 灌注液血糖變化

圖7 灌注液乳酸變化

圖8 灌注液總膽紅素變化

圖9 豬肝臟常溫機械灌注前外觀

圖10 豬肝臟常溫機械灌注后外觀

3 討論

圖11 豬肝臟常溫機械灌注前后的HE染色結(jié)果

常溫機械灌注能為供肝在體外提供營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣等，使供肝在體外仍然能維持正常的代謝水平。常溫機械灌注與常規(guī)的靜態(tài)冷保存相比，可延長保存、修復(fù)損傷的肝臟以及評價供肝質(zhì)量[9]。Butler等[10]對無缺血的豬肝臟進行長達72 h的常溫機械灌注，灌注結(jié)束時肝臟依然保持活性，轉(zhuǎn)氨酶仍處于正常水平，光鏡下肝臟小葉以及膽管組織結(jié)構(gòu)完整。Brockmann等[11]利用常溫機械灌注對無缺血的豬肝臟進行了20 h的保存，移植后5 d生存率明顯高于同時長的冷保存組，同時發(fā)現(xiàn)灌注保存期的轉(zhuǎn)氨酶水平與生存率具有相關(guān)性。Fondevila等[12]對熱缺血90 min的豬肝臟進行體外膜肺氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）聯(lián)合常溫機械灌注后進行移植，5 d生存率明顯高于冷保存組（100%與0）。

目前，離體肝臟常溫機械灌注設(shè)備研發(fā)最成熟的分別為英國牛津大學(xué)的Organ OX metra與荷蘭Organ Assist公司的Liver Assist，兩者都已經(jīng)開展了相關(guān)臨床實驗[13-16]。臨床上的數(shù)據(jù)再結(jié)合大量的動物移植實驗數(shù)據(jù)，使常溫機械灌注后供肝的移植前標準也逐步形成。Ravikumar等[17]使用Organ OX metra對20人的肝臟（其中4個為心臟死亡供體，16個為腦死亡供體）進行體外的恒壓常溫灌注并成功移植，移植后6個月的生存率為100%，作為對照組的靜態(tài)冷保存法在移植后6個月生存率則為97.5%，且術(shù)后常溫灌注組的受體AST最高峰遠低于靜態(tài)冷保存組。上述臨床實驗中，對于供肝的評價指標并不多，灌注過程中灌注液的pH值維持在7.2~7.4，同時肝臟平均保持著5 mL/h以上的膽汁生成量（被認為反映肝功能的最有價值指標[9]），而門靜脈流量平均保持在0.75~0.85 mL/min，肝動脈流量平均保持在0.15~0.3 mL/min。Watson等[18]從2014—2017年使用Liver Asisst對47個肝臟進行離體灌注，除了膽汁生成量、血液pH值、血液流量以外，還分別對灌注時期血液的ALT、乳酸以及血糖進行了監(jiān)測。其中選擇了ALT＜5 000 U/L、乳酸＜2.5 mmol/L的22個肝臟進行了移植，僅有1例因發(fā)生移植肝原發(fā)性無功能而死亡。

本研究采用DEVOCEAN-LIVER 2000進行常溫機械灌注。灌注初期，灌注液中的AST與ALT比生理值有較大的漲幅[ALT為（48.11±35.05）U/L，AST為（315.67±275.97）U/L]，這是由于實驗中需要對動物實施放血以及獲取肝臟后對血管修補等原因。肝臟共經(jīng)歷了11 min熱缺血與80 min冷缺血，再與DEVOCEAN-LIVER 2000連接恢復(fù)灌注后便形成了缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI），IRI能引發(fā)肝臟大量氧自由基的產(chǎn)生，損傷細胞膜，釋放出胞漿中的轉(zhuǎn)氨酶[19]。但隨后的灌注過程中，ALT與AST再未出現(xiàn)大幅度增長，灌注6 h后ALT為（63.14±43.69）U/L、AST為（740.00±281.98）U/L，動脈血的pH值維持在7.2~7.5，乳酸保持在（0.96±0.38）mmol/L，證明肝臟在DEVOCEAN-LIVER 2000常溫機械灌注的保護下能維持正常的代謝水平，保持活性，并有效抑制IRI的發(fā)生。以上生化與血氣指標均符合Watson等[18]移植前的供肝標準。在灌注后期會出現(xiàn)膽汁生成量明顯下降的現(xiàn)象，推測是由于膽汁的重要組分膽鹽缺乏而造成的。膽鹽在體內(nèi)經(jīng)過腸肝循環(huán)不斷重復(fù)利用生成膽汁[20]，而體外灌注的肝臟因缺少腸肝循環(huán)使膽鹽無法重新利用，最終導(dǎo)致膽汁生成量減少。Vogel等[21]在灌注液中以140 mg/h的量加入膽鹽，有效解決了膽汁生成量減少的問題。由于國內(nèi)缺乏無菌處理的膽鹽，因此本實驗并未加入膽鹽，導(dǎo)致灌注后期的膽汁生成量下降。但即便如此，DEVOCEAN-LIVER 2000灌注的肝臟在后期仍然持續(xù)生成膽汁。由于肝臟經(jīng)歷熱缺血后微循環(huán)堵塞，肝臟表面出現(xiàn)明顯的瘀斑，經(jīng)DEVOCEAN-LIVER 2000灌注6 h后瘀斑消失，灌注流量也逐步提高，證明肝臟內(nèi)血液循環(huán)有所改善。體外常溫機械灌注除了能直接改善供肝的質(zhì)量以外，還可以為藥物治療、基因干預(yù)等提供一個良好的科研平臺[22]。而這些優(yōu)勢都是使用傳統(tǒng)的靜態(tài)冷保存法無法實現(xiàn)的。

Organ OX metra采用的是單泵單氧合器的設(shè)計，該設(shè)備對血液氧合后由1個離心泵提供動力，分別進入動脈與門靜脈。其中動脈直接進入肝臟，而門靜脈到達設(shè)備頂端的血袋后，再經(jīng)重力作用進入肝臟，通過血袋的壓力閥對門靜脈灌注壓進行調(diào)節(jié)[18]。這種設(shè)計難以控制門靜脈的流速以及灌注壓[23]，而雙泵雙氧合設(shè)備能對動脈與門靜脈進行快速且獨立的調(diào)節(jié)，也可分開進行不同條件的氧合，更接近體內(nèi)肝臟門靜脈與動脈的情況。Liver Assist也采用了雙泵雙氧合設(shè)計，該設(shè)計主要將設(shè)備分為3個單元，1個離心泵和1個氧合器為一組，安裝至2個獨立的單元中，氧合后分2路進入第三部分儲肝器中，最后分別經(jīng)動脈以及門靜脈進入肝臟[13]。該設(shè)備是通過管路將3個獨立的單元連接在一起，管路較長，灌注液需求增加；安裝過程復(fù)雜，管路安裝不當(dāng)容易導(dǎo)致管路混入空氣、血液污染等問題的發(fā)生。與Liver Assist不同，DEVOCEAN-LIVER 2000將儲肝器、離心泵、氧合器以及管路整合至同一個套包中，僅需一步即可完成安裝，既方便消毒滅菌，又加快了臨床使用時的安裝速度。

綜上所述，DEVOCEAN-LIVER 2000能為肝臟在體外提供6 h穩(wěn)定的常溫機械灌注，使肝臟保持良好的狀態(tài)，符合移植的標準，同時操作性明顯優(yōu)于國外的設(shè)備，且價格更優(yōu)惠，對于提高我國的肝移植手術(shù)數(shù)量與質(zhì)量具有重要的意義。后續(xù)將開展灌注時間更長的實驗，以及不同類型的邊緣供肝的灌注實驗和大型動物的肝移植實驗，以進一步確定DEVOCEAN-LIVER 2000的安全性、穩(wěn)定性與有效性。