高效液相色譜法測定飲料中防腐劑的含量

劉志忠，袁 姍，高明珠

（1中國樂凱集團有限公司 河北 保定 071054）

（2樂凱膠片股份有限公司 河北 保定 071054）

1 引言

食品防腐劑能抑制微生物的活力，防止腐敗，延長食品的保質期[1]。大多數飲料和包裝食品需要長時間保存，需要添加食品防腐劑[2]。食品防腐劑也是一把“雙刃劍”，可能會給人們的健康帶來一些問題，能夠快速識別和準確量化飲料中的防腐劑是非常重要的[3]。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（1260），美國安捷倫公司；3680A超聲波清洗機，上海昆山儀器公司；AP系列無油真空泵，天津ORENT儀器有限公司；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計，上海普析通用儀器有限責任公司；HH-4數顯雙列四孔恒溫水浴鍋，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司；FA1204B電子天平，上海天美科學儀器有限公司；移液器，Ldragon公司。

甲醇（色譜純），北京百靈威科技有限公司；乙腈（色譜純），天津市永大化學試劑有限公司；異丙醇（光譜分析純），北京百靈威科技有限公司；醋酸銨（分析純），天津佳興化工玻璃儀器工貿有限公司；碳酸氫鈉（分析純），天津標準科技有限公司；氨水（分析純）永飛化學試劑有限公司；苯甲酸（分析純），麥克林試劑公司；山梨酸（分析純），麥克林試劑公司。

2.2 溶液的配制

2.2.1 標準品的配制

用分析天平準確稱取苯甲酸和山梨酸鈉于燒杯中，加入碳酸氫鈉溶液（20g/L）5mL，并加入50mL的純凈水，將燒杯置于80℃水浴鍋中，并震蕩至固體完全溶解，轉移至100mL容量瓶中，加水定容，搖勻得到1.0mg/mL的苯甲酸和山梨酸儲備溶液。將上述溶液稀釋，得到0.01g/L、0.02g/L、0.03g/L、0.04g/L、0.05g/L的混合標準溶液。

2.2.2 緩沖溶液的配制

用電子天平準確稱取乙酸銨（表1），配制一系列不同濃度的乙酸銨緩沖溶液。

表1 乙酸銨緩沖溶液的配制Table 1 Preparation of buffer solution of ammonium acetate

2.3 樣品的預處理

市售飲料開蓋后放入超聲波水浴中，進行30分鐘超聲波脫氣，去除飲料中氣體。再用無油真空泵進行減壓抽濾，除去飲料中的雜質。

分別準確量取預處理過的6種飲料50mL于100mL小燒杯中，用氨水（1+2）調pH，并用精密pH試紙測量其pH，當pH為6.8時，將混合液全部轉移至100mL容量瓶中，加水定容、搖勻，再用0.45μm濾膜過濾至樣品瓶中。

2.4 色譜條件優化

2.4.1 檢測波長的優化

在wavelength中設定掃描范圍為200～400nm，在樣品光路中的比色皿中分別放入山梨酸類和苯甲酸類溶液，點measure進行測定，得到苯甲酸和山梨酸類的紫外色譜圖。

2.4.2 流動相比例的優化

以甲醇和0.02mol/L乙酸銨緩沖溶液作為流動相，流速為1.0mL/min，檢測波長為230nm，柱溫箱30℃，流動相的比例變化范圍為甲醇：0.02mol/L乙酸銨=5∶95、10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、45∶55、50∶50，通過觀察色譜峰的形狀和計算分離度來確定最佳的流動相比例。

2.4.3 色譜柱溫度的優化

在甲醇：0.02mol/L乙酸銨=85∶15，檢測波長為230nm，流速為1.0mL/min的色譜條件下，通過改變色譜柱的溫度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，通過觀察色譜峰的形狀和計算分離度來確定最佳的色譜柱的溫度。

2.4.4 緩沖液濃度的優化

在甲醇：乙酸銨緩沖液=85∶15，檢測波長為230nm，色譜柱溫度為30℃，流速為1.0mL/min條件下，通過改變乙酸銨緩沖溶液的濃度為0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L，對乙酸銨緩沖液的濃度進行了優化，通過觀察色譜峰的形狀和計算分離度來確定最佳的緩沖液濃度。

2.5 標準曲線的繪制

設置色譜條件為：進樣量為10μL，流速為1.0mL/min，流動相為甲醇：0.02mol/L乙酸銨，色譜柱溫度為30℃，檢測波長為230nm，對不同濃度的山梨酸和苯甲酸類的混合溶液進行峰面積的測定，分別以山梨酸和苯甲酸類的色譜峰面積為縱坐標，以山梨酸和苯甲酸類的濃度為橫坐標進行作圖，得到山梨酸類和苯甲酸類的標準曲線。

3 結果與討論

3.1 色譜條件的確定

3.1.1 檢測波長的確定

通過對苯甲酸類和山梨酸類溶液的紫外吸收光譜的測定得到了山梨酸類和苯甲酸類的紫外吸收光譜圖（圖1），發現苯甲酸類在200～275nm波長范圍內具有紫外吸收，最大吸收波長在200nm處，山梨酸類在200～300nm的波長范圍內具有紫外吸收，最大吸收波長在255nm處。在220～250nm范圍內對檢測波長進行了優化（圖2），通過計算山梨酸類和苯甲酸類計算色譜峰之間的分離度，發現在檢測波長設定為230nm時，苯甲酸類和山梨酸類的峰高、峰型最好，分離度能夠達到兩者完全分離的要求，因此確定檢測波長為230nm。

圖1 紫外吸收光譜圖Fig. 1 Ultraviolet absorption spectrogram

圖2 不同檢測波長下山梨酸和苯甲酸類的色譜峰Fig. 2 Chromatographic peaks of sorbic acid and benzoic acid at different detection wavelengths

3.1.2 流動相比例的確定

實驗選擇甲醇和水作為流動相。在對流動相的比例進行優化的實驗中發現不同比例的流動相對分離度、保留時間、峰形和靈敏度有較大影響，隨著流動相中甲醇比例降低，山梨酸和苯甲酸類的色譜峰的分離度變大，保留時間變短，當流動相中，甲醇的比例為5%和10%時（圖3），苯甲酸的色譜峰出現嚴重的拖尾現象，為了保證山梨酸和苯甲酸類有合適的分離度，且待測樣品中山梨酸和苯甲酸類的色譜峰不受其他物質的干擾，確定流動相的比例為甲醇：0.02mol/L乙酸銨=15∶85。

圖3 探究流動相比例光譜圖Fig. 3 Spectrograms at different flow phase ratio

3.1.3 色譜柱溫度的確定

實驗對色譜柱的溫度進行了優化，隨著柱溫度的升高，苯甲酸和山梨酸類的保留時間變短（圖4），當溫度在20～35℃范圍內變化時，保留時間和分離度變化不大，但是分離度都能滿足大于1.5，即山梨酸和苯甲酸類的色譜峰能夠完全分離，本次實驗的色譜柱溫選擇為30℃。

圖4 不同柱溫下山梨酸和苯甲酸的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of sorbic acid and benzoic acid at different column temperatures

3.1.4 緩沖液濃度的確定

通過向純凈水中加入乙酸銨作為緩沖溶液，并對緩沖溶液的濃度進行了優化（圖5），發現當緩沖液濃度為0.01mol/L時，色譜峰形狀較差，當緩沖液濃度在0.02～0.05mol/L范圍內變化時，色譜峰的形狀較好，半峰寬和分離度變化不大，由于緩沖液的濃度應盡可能低，因此選擇緩沖液的濃度為0.02mol/L。

圖5 不同緩沖溶液濃度下山梨酸和苯甲酸的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of sorbic acid and benzoic acid in different buffer concentration

3.2 精密度

在確定了的最佳實驗條件下重復實驗6次。苯甲酸類和山梨酸類的相對標準偏差分別為0.067%、0.032%（表2）。

表2 兩種防腐劑的精密度的測定Table 2 Determination of the precision of two preservatives

3.3 標準曲線繪制

以山梨酸和苯甲酸類的質量濃度為橫坐標，色譜峰的峰面積為縱坐標進行繪圖，得到山梨酸和苯甲酸類的標準曲線（圖6）、（圖7）和其線性回歸方程（表3）。

圖6 山梨酸類標準曲線圖Fig. 6 Standard curve of sorbic acid

圖7 苯甲酸類標準曲線圖Fig. 7 Standard curve of benzoic acid

表3 線性回歸方程表Table 3 Linear regression equation table

3.4 樣品的測定

在最佳色譜條件下，對市售幾種飲料進行了檢測，通過標準曲線，計算樣品中的苯甲酸類和山梨酸類防腐劑的含量（表4）。

表4 樣品中防腐劑的含量表Table 4 Table of preservative content in sample

所測定的樣品中防腐劑的含量均符合GB2760的規定。

4 結論

本文通過安捷倫1260型高效液相色譜儀，采用ZORBAX SB-C18色譜柱和可變波長檢測器，建立了一種用高效液相色譜法同時測定飲料中常見的防腐劑：山梨酸類、苯甲酸類的檢測方法，其相對標準偏差分別為0.032%和0.067%。該方法能夠量化的測定飲料中山梨酸類和苯甲酸類防腐劑，避免了對人體健康產生不良影響，具有簡便、快速、準確度高的特點。