UPLC法測定豆?jié){中嘌呤含量及GCB對嘌呤吸附的研究

毛玉濤 樊 平 黃 洋 余鳳江 石應豪

(貴陽市糧油質量檢測中心，貴陽 550002)

豆?jié){作為一種優(yōu)質的植物蛋白飲品，被認為是一種合適和經濟的牛奶替代品，也是乳糖不耐受者的理想營養(yǎng)補充品[1]，其含量豐富的植物蛋白、磷脂、維生素及礦物質等，以其濃郁獨特的豆香口感備受人們親睞，長期飲用還可達到預防疾病的效果[2-5]。但因豆類中嘌呤含量較高，若不限量攝入易促使痛風病人引發(fā)痛風[6，7]。嘌呤是核酸的重要組成部分，是生物體內新陳代謝過程中的重要物質[8]。核酸類物質中核糖與嘌呤之間的糖苷鍵斷裂，從而產生游離嘌呤堿和無嘌呤位點的過程稱為脫嘌呤現(xiàn)象[9]。通過一些物理、化學及生物方法[10]對食品中嘌呤物質進行脫除成為近年來食品生物技術的熱點。

GCB，即石墨化碳黑，作為一種新型吸附劑，其表面光滑無孔的石墨晶型結構決定其對非極性化合物、弱極性化合物和部分極性化合物都具有一定的吸附作用，且通過過濾或離心等物理方法即可實現(xiàn)吸附劑與吸附基質的有效分離，近年來被廣泛應用于化合物的分離和色素去除。邵華等[11]在固相萃取柱法和基質固相分散法的樣品前處理中運用到GCB；宋巍等[12]在測定藥用明膠空心膠囊中的六價鉻時，利用GCB脫除提取液中的著色劑；同時，GCB應用范圍還涉及農藥殘留檢測[13]和獸藥殘留檢測[14]等領域。

本團隊在前期研究的基礎上，利用超高效液相色譜(UPLC)法建立豆?jié){中腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤四種嘌呤的多組分分析檢測方法，應用新型吸附劑GCB作為食品加工助劑[15]對豆?jié){中的嘌呤物質進行吸附處理，通過物理方法去除吸附劑GCB，在保持了豆?jié){原有營養(yǎng)價值及口感風味的同時獲得了較高的嘌呤脫除率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

東北大豆；腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤標準品(粉末)；氫氧化鈉、氫氧化鉀、磷酸、磷酸二氫鉀、三氟乙酸、甲酸；純凈水(超純過濾)；甲醇、異丙醇-水混合清洗液；及各種檢測試劑均為色譜純；GCB(石墨化碳)為分析純。

超高效液相色譜儀(Nexera LC-40)，超聲波清洗器(JP-020S)，酸度計(ST3100)，高速冷凍離心機(TGL-20M)，磁力攪拌器(RET CVW S025)，集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S)，超純水系統(tǒng)(Milli-Q Direct8)，立體超低溫冰箱(U410)，豆?jié){機(Power30)。

1.2 UPLC檢測條件

本實驗利用超高效液相色譜法對豆?jié){中嘌呤的含量進行測定。色譜分離條件為: Shim-pack C18反相柱(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)色譜柱，以0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH 2.95)作為流動相，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量3 μL，檢測波長(λ1)為254 nm[16]。

利用最優(yōu)色譜條件分別進樣檢測濃度為0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/mL的四種嘌呤標準物質混合溶液，以嘌呤濃度梯度為橫坐標、以峰面積為縱坐標繪制四種嘌呤物質的標準曲線，確定線性范圍。

1.3 豆?jié){中嘌呤物質的水解和測定

根據本課題組前期研究結果[16]，確定本實驗豆?jié){嘌呤物質的水解條件為：取10 mL樣品于50 mL燒瓶中，加入10 mL三氟乙酸與甲酸(1∶1)的混合液，在98～101 ℃油浴鍋中密封水解1 h，迅速冰浴冷卻，用12.5 mol/L KOH溶液中和，再用50%的H3PO4調pH至2.95，定容50 mL，離心，0.22 μm濾膜過濾，在254 nm波長處測定，根據標準曲線求出嘌呤的含量。

考察浸泡大豆(12 h)與干大豆[17]；去渣豆?jié){與原磨豆?jié){；調pH與離心先后順序對原豆?jié){中嘌呤水解及嘌呤本底值測定結果的影響。

1.4 嘌呤吸附率的計算

研究表明，大豆中嘌呤總含量>200 mg/100 g，屬于高嘌呤食品[18,19]，嘌呤含量高于其他豆類[20]。大豆中嘌呤物質主要為腺嘌呤和鳥嘌呤，次黃嘌呤和黃嘌呤含量較少[21]，僅占到嘌呤總含量的2%，因此本實驗研究豆?jié){嘌呤吸附率以大豆中腺嘌呤和鳥嘌呤含量之和計算。

豆?jié){中嘌呤物質的去除率可用公式進行計算：

式中：C0為處理前豆?jié){中嘌呤的含量/mg/100 g；C為處理后豆?jié){中嘌呤的含量/mg/100 g。

1.5 GCB對嘌呤標準物質的吸附方法

配置同濃度10 mg/L的四種嘌呤標準品混合溶液，加入一定量的GCB，超聲10 min，調pH值至2.95，0.22 um濾膜過濾，上機檢測，考察GCB的添加量對嘌呤的吸附率。

1.6 豆?jié){中嘌呤物質脫除工藝

黃豆→去雜浸泡→磨漿過濾→超聲→加GCB→振蕩吸附→離心(10 min)→成品

取東北優(yōu)質大豆，清水浸泡12 h，以1∶10大豆與水的質量體積比用豆?jié){機打磨過濾得到熟豆?jié){，取50 mL豆?jié){于錐形瓶中，超聲處理一定時間，加入一定量的GCB，在一定溫度和頻率下振蕩吸附一定時間，離心得到低嘌呤豆?jié){。

探究嘌呤的吸附工藝：分別考察吸附劑對經超聲處理與不超聲處理的豆?jié){；同等時間下靜置、振蕩與磁力攪拌的吸附環(huán)境；脫除GCB的離心轉速對豆?jié){嘌呤吸附率的影響。

1.7 GCB對嘌呤物質吸附特性的探究

考察GCB添加量、吸附振蕩時間、吸附振蕩頻率這3個因素對豆?jié){中嘌呤物質吸附效果的影響。

1.8 數(shù)據統(tǒng)計分析方法

所有實驗均設3次重復，取平均值，利用Origin分析系統(tǒng)對數(shù)據進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 UPLC法對嘌呤的檢測分析

2.1.1 4種嘌呤物質的分離效果

對嘌呤混合溶液進樣分析測定。由圖1可見，與普通的HPLC嘌呤分析方法相比，本實驗利用的UPLC分析方法具有分離效能高，分析速度快等特點。4種嘌呤物質在10 min內全部出峰，峰形、出峰時間及分離度均比較穩(wěn)定，出峰順序依次為：鳥嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤。

圖1 4種嘌呤物質分離色譜圖

2.1.2 4種嘌呤物質的標準曲線

由表1可得，本實驗用UPLC法建立了鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤峰面積與相應濃度的線性回歸方程，在0.5～40 mg/L的濃度范圍內，4種嘌呤的線性相關系數(shù)均高達0.999 99。

表1 4種嘌呤的標準曲線

2.2 不同因素對原豆?jié){中嘌呤物質測定的影響

食品中的嘌呤物質一般以核酸堿基的形式存在，尤其是一些高嘌呤含量食品，因此需先通過酸水解、超聲波萃取或超臨界萃取等提取分離技術將其從食品或生物制品中提取出來再進行分析測定，通過前期研究，用酸水解的方式將嘌呤物質從豆?jié){中水解出來再進行分析測定。同時，為準確測得原豆?jié){中嘌呤物質的含量，排除前處理過程中幾個關鍵因素對GCB嘌呤吸附率高低的影響，獲得的實驗結論對低嘌呤豆?jié){的研究有重要意義。

2.2.1 干豆和浸泡大豆對原豆?jié){中嘌呤結果測定的影響

同等實驗條件下，大豆浸泡12 h與干大豆直接打磨制得的2種豆?jié){，進行水解，上機后檢測得到：經浸泡后大豆制備的豆?jié){嘌呤本底值結果略高于干豆制備的豆?jié){，且經浸泡后的大豆打磨的豆?jié){口感更加細膩醇厚，因此，確定大豆清洗除雜后浸泡制備豆?jié){進行實驗研究。

2.2.2 豆渣過濾對原豆?jié){中嘌呤結果測定的影響

同等實驗條件下，原磨和去渣熟豆?jié){，用本實驗的水解及測定方法處理后，做6次精密度實驗測得豆?jié){中嘌呤物質含量本底值分別為156.25、147.48 mg/100 g，經過濾豆渣后的原豆?jié){其嘌呤測定結果略低于含渣豆?jié){，這是由于豆渣中也含有部分嘌呤物質，經過濾處理后有損失。由此可見豆渣是否過濾對原豆?jié){中嘌呤物質的水解及測定結果有一定影響，但結果相差不大，由此而制備的低嘌呤豆?jié){亦可有原磨及去渣兩種，供痛風病人選擇飲用。

2.2.3 pH值調節(jié)方式對原豆?jié){中嘌呤結果測定的影響

經酸水解后的豆?jié){需將其pH值調至2.95(UPLC流動相的pH值)，經離心再通過0.22 μm濾膜過濾后上機檢測[16]。在具體實驗操作中，由于10 mL豆?jié){與10 mL酸水解溶液經油浴水解冰浴冷卻后，酸性極強，用12.5 mol/L的氫氧化鉀溶液調pH時，強烈的酸堿中和反應產生巨大的熱量，促使萃取溶液產生大量絮狀物沉淀，且揮發(fā)出刺激性氣體，既傷害實驗人員身體，又對嘌呤的水解產生影響，還由于大量鹽的加入，使得高效液相色譜柱及流路堵塞發(fā)生鹽析。

對此，本實驗嘗試了冰浴后的萃取液先離心過濾，取少量上清液2.5 mL后調pH值以改善上述不良影響。實驗結果表明，改進后的方法對原豆?jié){嘌呤含量的測定無影響，值得在植物性高嘌呤食品的測定中推廣。

2.3 嘌呤物質含量的測定結果

經測定，本實驗用東北優(yōu)質大豆，以10∶1(g∶mL)料液比研磨后的熟豆?jié){，嘌呤物質含量以大豆計分別為：鳥嘌呤98.78 mg/100 g、腺嘌呤52.00 mg/100 g、黃嘌呤4.19 mg/100 g、次黃嘌呤1.28 mg/100 g，嘌呤總含量為156.25 mg/100 g。

2.4 不同濃度GCB對不同嘌呤標準物質的吸附效果

向已知濃度10 mg/L的4種嘌呤標準混合溶液中分別加入0.005、0.01、0.02、0.03、0.04 ug/mL的GCB，不同溶度的GCB對4種嘌呤物質的吸附效果如圖2所示。

圖2 不同濃度的GCB對4種嘌呤物質的吸附效果

由此可見GCB對4種嘌呤均具有較高的吸附率，在添加量為0.04 μg/mL時，GCB對鳥嘌呤和黃嘌呤標準品的吸附率達到了90%以上。根據數(shù)據統(tǒng)計分析結果，4種嘌呤物質的吸附率與GCB的添加量呈良好的線性關系，在P<0.05情況下，不同濃度的GCB對四種嘌呤物質吸附結果具有顯著性差異。GCB(120/400 目)比表面積100 m2/g-1，因其非多孔性，對樣品的吸附不要求其擴散至有孔區(qū)域，所以萃取過程非常迅速。這是由于GCB碳表面的正六元環(huán)結構，使其對平面分子有極強的親和力。而嘌呤是一種含C、N的環(huán)狀結構，分子式為C5H4N4，能夠與GCB的正六元環(huán)結合成為較穩(wěn)定的平面網狀結構，因此可達到較高的吸附率。

2.5 不同吸附工藝的對比與討論

2.5.1 豆?jié){超聲處理對嘌呤吸附率的影響

從測定結果來分析，將同濃度的GCB加入未經超聲處理的豆?jié){和經超聲10 min處理后的豆?jié){中，經超聲后嘌呤物質的吸附率高于未經超聲的豆?jié){。這是因為超聲波在溶劑和樣品之間產生聲波空化作用，導致溶液內氣泡的形成、增長和爆破壓縮，從而使固體樣品分散，增大樣品與萃取溶劑之間的接觸面積，提高目標物從固相轉移到液相的傳質速率[18]。

圖3 豆?jié){超聲處理對嘌呤物質吸附效果的影響結果

2.5.2 吸附環(huán)境對嘌呤吸附率的影響

實驗對比了同等條件下，不同吸附環(huán)境對嘌呤物質的吸附效果的影響。結果表明，3種條件吸附率從高到底依次為：振蕩(250 r/min)>磁力攪拌(1 000 r/min)>靜置。振蕩與磁力攪拌差別不大，且從吸附結束后分離GCB的難易度程度來看，磁力攪拌處理使得GCB與豆?jié){中的蛋白質、脂肪等大分子物質形成緊密粘合，導致離心和過濾均不能完全將GCB除去，因此，確定GCB的吸附環(huán)境為常溫下振蕩吸附。

2.5.3 脫除GCB的離心轉速對嘌呤吸附率的影響

經GCB吸附處理后的豆?jié){，需經過離心脫除GCB，再經酸水解后上機測定嘌呤含量。本實驗控制離心時間為10 min，探索不同轉速對吸附劑GCB的脫除效果及嘌呤吸附率的影響，實驗結果表明，轉速在達到8 000 r/min及以上時，豆?jié){中GCB脫除較徹底，肉眼觀察豆?jié){呈現(xiàn)正常的乳白色，無GCB殘留。隨著轉速的增加，GCB脫除越徹底，同時豆?jié){中嘌呤含量越低。但是考慮到工業(yè)化生產的實際情況，建議中試選擇12 000 r/min(10 min)的離心條件。

2.6 不同因素對GCB脫除豆?jié){中嘌呤物質吸附率的影響

2.6.1 GCB添加量對豆?jié){嘌呤吸附率的影響

從圖4可以看出，隨著GCB添加量的不斷增大，豆?jié){中嘌呤物質的吸附率逐漸增大。根據食品工業(yè)用加工助劑使用原則“使用時應具有工藝必要性，在達到預期目的的前提下應盡可能降低使用量”[12]，同時從節(jié)約成本方面考慮，可以選擇GCB在0.01g/mL濃度下進行中試。

圖4 不同因素對GCB脫除豆?jié){中嘌呤物質吸附率的影響

2.6.2 振蕩時間對豆?jié){嘌呤吸附率的影響

由圖4可以看出，隨著振蕩反應時間的增加，嘌呤的吸附率呈現(xiàn)先增加，再趨于平緩的趨勢。其中振蕩處理60 min，嘌呤脫除率達到最大。說明一定濃度和條件下GCB對豆?jié){中嘌呤物質的吸附有一個“時間閾”，超過60 min出現(xiàn)解吸現(xiàn)象，因此吸附時間1 h最佳。

2.6.3 振蕩頻率對豆?jié){嘌呤吸附率的影響

由圖4可以看出，隨著振蕩頻率的增加，嘌呤的吸附率呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，振蕩頻率為250 r/min時，嘌呤脫除率達到最大，再提高振蕩頻率會發(fā)生解吸現(xiàn)象，企業(yè)可根據實際條件選定該頻率進行中試。

2.7 低嘌呤豆?jié){的品質評價

使用GCB吸附的方法對豆?jié){中的嘌呤物質進行脫除，再通過離心去除吸附劑GCB，得到的豆?jié){其感官要求(外觀色澤、氣味滋味、組織狀態(tài))正常，具有豆?jié){應有的氣味與滋味。

將原豆?jié){及經GCB吸附處理后的低嘌呤豆?jié){進行品質對比，其理化指標(固形物含量、蛋白質含量和脂肪含量)測定結果分別見表2，經處理后的低嘌呤豆?jié){營養(yǎng)有一定損失，但檢測結果完全達到了QB/T 2132—2008中的要求。

表2 GCB吸附處理后的豆?jié){理化指標檢測結果

3 結論

本研究針對豆?jié){中含有的嘌呤，采用UPLC法建立了豆?jié){中腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤4種嘌呤的多組分分析檢測方法，測得本實驗用東北優(yōu)質大豆嘌呤總含量達到了156.25 mg/100 g；選用新型吸附劑GCB作為食品加工助劑對豆?jié){中的嘌呤物質進行吸附處理。探索了吸附工藝和條件對豆?jié){吸附率的影響；改進了豆?jié){嘌呤酸水解及UPLC分析測定的條件，探究了GCB的吸附性能，在保持了豆?jié){原有營養(yǎng)價值及口感風味的同時，獲得了57.23%的嘌呤脫除率，為低嘌呤豆?jié){及低嘌呤豆制品的工業(yè)化生產提供技術參考。