唐古特大黃(Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.)功效組分地理變異及氣候響應特征

楊芙蓉,冉家棟,劉海濤,宋經元,謝彩香,*

1 中國醫學科學院 北京協和醫學院藥用植物研究所 國家中醫藥管理局中藥資源保護重點研究室, 北京 100193 2 中藥資源教育部工程研究中心, 北京 100193

唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim. ex Balf.)為蓼科大黃屬(RheumLinn.)多年生高大草本植物,為中藥材大黃的原植物之一,青海省是其著名的道地產區。唐古特大黃的藥用歷史悠久,具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒等功效[1]。現代藥理學研究表明,與這三種主要功效相關的活性成分可分為四類,即具有抑菌功效的游離蒽醌類成分,具有瀉下功效的結合蒽醌類成分和雙蒽酮類成分,具有抗凝血功效的多酚類成分(主要是沒食子酸和兒茶素)[2- 6]。大黃為我國傳統常用大宗中藥材,《中華人民共和國藥典》(2015版)收載的含大黃成分的中成藥多達105種,全國中藥制劑中含有大黃成分的比例高達10%[7]。

藥用資源化學成分的種類及含量的地域性差異是中藥材道地性的一種具體體現。特定生態環境條件與遺傳基因相輔相成,充分體現了中藥的特殊性、地道性和繼承性。《本草經集注》“諸藥所生,皆有境界”,《唐本草》“離其本土,則質同而效異”,這些記載都說明了生態環境對中藥品質影響的重要性。有研究者認為“物種內質量變異有時大于種間差異”是現代道地論的核心思想[8]。另有學者研究發現,不同產地的唐古特大黃其功效組分含量有顯著差異,且化學成分與環境因子間存在強關聯性[9]。大黃是多道地產區藥用植物的典型代表,青海和甘肅是唐古特大黃和掌葉大黃(RheumpalmatumL.)的主產區。因此,唐古特大黃品質地域性以及與產地氣候間的響應關系是闡釋唐古特大黃道地性的重要環節。

古人用產地作為道地藥材品質的映射體現出整體性思想,藥材的道地性成因是中醫藥領域研究的熱點。目前,對中藥道地性形成的環境因子和生物因子等雖有所研究,但往往是針對個別因子的單因子影響研究,缺乏對環境因子的綜合性和系統性研究[10-20]。目前,對不同產區大黃的成分差異及炮制方法,資源分布以及藥理研究較多[21- 28],但對影響唐古特大黃品質形成的氣候因子和響應特征的研究還比較少[29- 30],尤其是尚未見到有關唐古特大黃與多尺度氣候因子的系統性研究。因此,本文基于不同產地唐古特大黃的功效組分含量對多產地的唐古特大黃進行生態型劃分,并基于多尺度氣候因子和多種數學統計方法,系統研究氣候因子與唐古特大黃品質的響應特征,明確道地藥材唐古特大黃的氣候響應特征,探索唐古特大黃品質地理變異的氣候成因,揭示大黃不同化學生態型形成的生態學機制,為唐古特大黃高品質種植區選址及其資源可持續發展提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1唐古特大黃樣本

文中關于唐古特大黃樣本點信息和化學功效組分含量的數據引自李莉對不同道地產區大黃藥材質量特征的研究結果[31]。本文調查的唐古特大黃樣本點共11批,分別來自于大黃的主要產區四川、甘肅、寧夏、青海省。研究樣本的采樣信息見表1,樣本點分布圖見圖1。

表1 唐古特大黃樣本點地理信息表

圖1 唐古特大黃采樣點Fig.1 Sampling localities of Rheum tanguticum

1.1.2氣候數據

本文所采用的氣候數據包含三個時間尺度(表2),首先是4個年均因子,來源于中國氣象數據網共享平臺；其次是17個反映季節性變化的綜合氣候因子,來源于世界氣候數據庫(http://www. worldclim.org/),為1970—2000年監測數據的平均值,空間分辨率為2.5 min；然后是4個月均因子,反映溫度、降水和日照等因子在月際間的動態變化。

表2 環境變量

1.2 方法

1.2.1唐古特大黃品質測定

采用HPLC法測定唐古特大黃樣品中游離蒽醌類(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚)、總蒽醌(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚)、結合蒽醌(總蒽醌含量-游離蒽醌含量)、多酚類(沒食子酸、兒茶素)、雙蒽酮苷類(番瀉苷A、番瀉苷B)等組分含量。Agilent1100高效液相色譜儀(DAD二極管陣列檢測器),色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相為0.05%的磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脫(0—10 min,5%B—11%B；10—30 min,11%B—15%B；30—45 min,15%B—17%B；45—60 min,17%B—22%B；60—75 min,22%B—36%B；75—90 min,36%B—60%B；90—105 min,60%B；105—110 min,60%—5%B)；流速1.0 mL/min1；檢測波長 250nm;柱溫40℃；進樣量10μL。

1.2.2數據分析

采用Excel和SPSS 25.0進行統計數據分析,運用Matlab、Prism 8.0進行圖表繪制。用 Analyze-Descriptive Statistics 法標準化處理不同量綱數據,得到標準化結果后進行數據統計分析。聚類分析將數據線性標準化后采用系統聚類法,分析方法采用組間聯結和Pearson距離法。相關性分析采用SPSS中Pearson相關性分析。

2 結果與分析

2.1 唐古特大黃品質地理變異

不同產地間唐古特大黃4種功效組分間的含量具有明顯的地理變異(表3)。圖2顯示青海和甘肅所產唐古特大黃聚成一類,四川產唐古特大黃單獨成一類。圖3顯示不同地區唐古特大黃4種功效組分含量有顯著性變化,尤其是游離蒽醌類、結合蒽醌類和多酚類化學物質含量隨地域變化很大。根據4種功效組分含量,唐古特大黃可劃分為青海-甘肅型和四川型兩種化學生態型。其中青海-甘肅型中結合蒽醌和多酚類物質含量比較高,而四川型中游離蒽醌含量比較高。青海-甘肅型中結合蒽醌類含量比例為66.9%,而四川型中游離蒽醌類含量比例為70%。圖4顯示不同地區大黃多酚類成分也具有明顯地理變異,其中青海-甘肅型樣本中多酚類成分含量高于四川型樣本,而雙蒽酮類成分沒有明顯的地域差異。

圖4 唐古特大黃4種功效組分含量熱圖Fig.4 The heatmap of functional compositions in Rheum tanguticum

表3 唐古特大黃樣本組分含量結果/%

圖2 唐古特大黃化學成分聚類圖 Fig.2 The cluster diagram of chemical compositions of Rheum tanguticum S-SP: 四川松潘, S-TK: 四川唐克, S-DG: 四川德格, Q-JZ: 青海久治, Q-QL: 青海祁連, Q-GD: 青海貴德, Q-TD: 青海同德, Q-DR: 青海達日, Q-MQ: 青海瑪沁, G-XH: 甘肅夏河, G-TZ：甘肅天祝

圖3 唐古特大黃4種功效組分含量堆積圖Fig.3 The stacked bar of function compositions

2.2 唐古特大黃品質對氣候因子的響應

基于年-季-月不同時間尺度的氣候因子,逐次分析唐古特大黃品質與氣候因子間的響應關系。

2.2.1年均氣候因子

圖5顯示唐古特大黃4種成分與年均日照時數呈正相關。游離蒽醌類物質與4個年均氣候因子相關性最弱,其次是雙蒽酮類物質,而結合蒽醌類物質和多酚類物質與4個年均氣候因子都有一定的相關性。

圖5 唐古特大黃功效成分與年均因子相關性的冗余分析 Fig.5 Analysis (RDA) of relationships between functional composition in Rheum tanguticum and annual factors

表4可知結合蒽醌和多酚類物質與4種年均因子有較大相關性。其中,結合蒽醌類物質與年均溫呈顯著負相關；多酚類物質與年均溫和年降水呈負相關,而與日照正相關。說明低溫少雨且日照時間長的地區適宜結合蒽醌和多酚類物質的產生與積累。

表4 唐古特大黃4種功效組分與年均氣候因子的相關系數

2.2.2季度氣候因子

表5說明四類組分中只有結合蒽醌和多酚類物質與氣候因子間有一定相關性,這與2.2.1中結論是一致的。

表5 唐古特大黃4種功效組分與季度氣候因子間的相關系數

在0.01水平上,與結合蒽醌類物質具有顯著負相關的氣候因子Bio 9(最干季平均溫度)、Bio 11(最冷季平均溫度),說明低溫有利于結合蒽醌類物質的累積；在0.05水平上,與結合蒽醌類物質具有負相關性的氣候因子有Bio 3(等溫性)、Bio 5(最熱月份最高溫)、Bio 6(最冷月份最低溫)、Bio 10(最熱季平均溫度),說明溫度變化劇烈的地區有助于結合蒽醌類物質的積累,最熱月份和最冷月份溫度越低對結合蒽醌物質形成越有利；而與Bio 4(溫度季節性變化系數)呈現顯著正相關,說明溫度變化劇烈有利于結合蒽醌物質形成。

在0.01水平上,多酚類物質與Bio 3(等溫性)負相關,與Bio 4(溫度季節性變化系數)正相關,說明一年中的溫度變化劇烈有利于多酚類物質形成。在0.05水平上,與多酚類物質具有顯著負相關的氣候因子為Bio 2(晝夜溫差月均值)、Bio 9(最干季平均溫度)、Bio 11(最冷季平均溫度)、Bio 16(最濕季降雨量)、Bio 18(最暖季降雨量),說明晝夜溫差大和最冷季的低溫有助于多酚類物質累積,同時降水量越少越有助于多酚類物質形成。

總之,溫差大(晝夜溫差,季節溫差),溫度低且降水量少的區域有助于唐古特大黃中結合蒽醌類和多酚類物質的形成和累積。

2.2.3月均因子

通過2.2.1和2.2.2研究表明,降水量、均溫和日照均影響唐古特大黃的組分形成,為深入研究氣候因子對各成分的動態影響,進一步分析在月均尺度上三個因子與唐古特大黃功效組分間的相關性,結果見表6、圖6、表7。表6顯示除了游離蒽醌與每月平均氣溫(7月和8月除外)呈現正相關外,其他三種功效組分與每月平均氣溫都是負相關,符合2.2.1部分結論。其中,與結合蒽醌類物質呈強負相關的是1月至6月氣溫和9月至12月氣溫,說明最干季節的低溫對結合蒽醌累積有利。而月氣溫對多酚類物質的影響不顯著,只有1月至4月氣溫和12月氣溫低溫對多酚類物質累積有促進作用。

表6 唐古特大黃4種功效組分與月平均氣溫的相關系數

圖6說明每月平均降水量只有對多酚類物質有一定的響應。多酚類物質與6—7月平均降水量、9—10月平均降水量呈負相關,說明在最濕季降水量越少越有助于多酚類物質形成。

圖6 唐古特大黃4種功效組分與月平均降水量的相關系數 Fig.6 Heatmap for correlation analysis of monthly average precipitation and functional compositions in Rheum tanguticumPrec1—12:1—12月月均降水量；* 0.05級別(雙尾)相關性顯著；* * 0.01級別(雙尾)相關性顯著

表7說明,每月平均日照量與結合蒽醌和多酚類物質都呈正相關。尤其是多酚類物質在唐古特大黃生長季節呈現出與日照的強正相關性,說明在唐古特大黃的生長季,日照量對多酚類物質累積有促進作用。

表7 唐古特大黃4種功效組分與月平均日照量的相關系數

2.3 大黃不同品質區氣候特征

上述研究結果說明,只有月均溫和月均日照量與結合蒽醌和多酚類物質呈強相關性。因此,通過分析這兩種因子在唐古特大黃不同品質區的氣候差異,以期獲得唐古特大黃不同品質區的氣候特征。

圖7顯示兩區域的月均溫差呈現大-小-大的漏斗形,即1到4月份溫差較大,而從5月到8月兩區域間的溫差變小,從9月到12月溫差又變大。說明影響結合蒽醌和多酚類物質累積的主要時間窗口(最冷季)內,兩區域間的月均溫有較大差異。圖8顯示青海-甘肅區域內的每個月的月均日照量都高于四川區域,但在5—8月份期間,兩地區間差值較小。根據表5和表6的結論,最冷季月均溫與結合蒽醌物質和多酚類物質均呈負相關,而每月日照量與多酚類物質呈正相關,青海-甘肅地區由于最冷季(1至5月份,9至12月份)每月平均氣溫遠低于四川地區,且每月日照量均高于四川地區,所以青海-甘肅地區結合蒽醌物質和多酚類物質含量高于四川地區,這恰恰闡釋了青海-甘肅地區和四川地區的唐古特大黃品質存在差異的氣候原因。

圖7 不同地區月均溫箱線圖Fig.7 Boxplot of monthly average temperature in different regions

圖8 不同地區月均日照量箱線圖Fig.8 Boxplot of monthly average solar radiation in different regions

3 討論

藥用植物化學成分含量的地域性差異是中藥材道地性的一種具體體現。“產之有地,采之有時,清潔加工,依古炮制”,說明一定的產地環境是保障道地藥材好品質的重要環節[32]。

3.1 唐古特大黃化學成分地理變異

除雙蒽酮類成分外,不同產地間唐古特大黃中功效組分含量具有明顯的地理變異,可劃分為青海-甘肅型和四川型兩種化學生態型。其中,青海-甘肅型中結合蒽醌和多酚類物質含量比較高,而四川型是游離蒽醌含量比較高。由于大黃泄下功效的主要物質基礎是結合蒽醌類物質,因此,青海和甘肅地區唐古特大黃的泄下功效比較強[33- 34]。

3.2 唐古特大黃品質與氣候因子的響應

本文首次采用不同時間尺度的氣候因子,研究影響唐古特大黃品質形成的關鍵氣候因子和主要時間窗口。

(1)在年均因子層次上,結合蒽醌和多酚類2種組分與4種年均因子具有一定的相關性。低溫少雨且日照時間長的地區適宜結合蒽醌和多酚類物質的積累。由于甘肅-青海和四川地區在溫度、日照和降水方面的差異,導致了不同地區唐古特大黃在結合蒽醌和多酚類物質含量存在明顯差異。

(2)在季均因子層次上,溫度變化劇烈且最冷季度時(最干季度)溫度低的地區,有利于結合蒽醌類物質的累積。同時,溫度變化幅度大(晝夜溫差、季節性浮動),最冷季溫度低且降水量少的地區,有助于多酚類物質形成。這與年均尺度因子結論一致。

(3)在月均因子層次上,只有結合蒽醌和多酚類物質與月均溫度因子和日照因子間具有強相關性,這一結論在三個時間尺度上具有一致性。結果表明,最冷季度時溫度越低越有利于結合蒽醌類物質和多酚類物質的累積。每月平均日照量與結合蒽醌和多酚類物質都呈正相關,尤其是對多酚類物質影響最大。相關性研究數據表明,多酚類物質在唐古特大黃生長季節呈現出與日照的強正相關性,說明在唐古特大黃的生長季,高日照量對多酚類物質累積有促進作用。

總而言之,月均溫和月均日照量是導致青海-甘肅和四川兩個產區唐古特大黃品質差異的主要氣候原因,且兩地區間氣候差異的主要時間窗口為1—6月份和9—12月份。這與車國東等[35]所研究栽培唐古特大黃蒽醌含量的季節動態變化結果相一致。本文基于多層次氣候因子的相關性研究結果,探討了道地藥材唐古特大品質地域差異的氣候成因。

3.3 唐古特大黃品質形成因素探討及研究展望

中藥材品質的形成受環境、遺傳等諸多因素的影響。有學者發現不同道地產區唐古特大黃藥材質量產生差異的原因與其遺傳背景差異有關系[36- 37]。此外,有學者認為環境是影響唐古特大黃組分的主要因素,其次才是種源[38]。而環境主要是包括氣候和土壤因素,土壤對藥用植物的生長發育、活性成分的合成積累有較大影響[39]。有研究表明藥用植物鎖陽兩個道地產區土壤微生物群落存在多樣性差異[40]；不同的土壤營養元素和無機元素差異導致大黃藥材功效組分間的含量有顯著差異,這也進一步說明土壤因素也是形成藥材道地性的主導因子[41]。由此可知,不同地區的氣候和土壤條件差異是導致藥材品質區域變異的主要生態因素。本文著重從多層次氣候因子角度深入研究造成唐古特大黃品質差異的氣候原因,探索影響唐古特大黃品質形成的關鍵氣候因子和主要時間窗口,在后續的唐古特大黃品質研究中會繼續考慮土壤條件對唐古特大黃品質的影響。同時,進一步對唐古特大黃進行代謝組學研究和產區試種,期望全面揭示唐古特大黃道地性的生態機制。