鵝副黏病毒甘肅地方毒株的分離和初步鑒定

王 丹

（白銀市白銀區獸醫站，甘肅 白銀 730900）

鵝副黏病毒病是一種急性和高度傳染性的鵝感染，由I型鵝衍生的副黏病毒（Avian Paramyxovirus Serotype-1，APMV-1）引起的接觸性傳染病。病原為鵝副黏病毒（APMV），屬于副黏病毒科、腮腺炎病毒屬，病毒核酸為帶有負鏈的單鏈RNA。APMV有9種血清型，其中APMV-1是家禽中最重要的病原體，在世界許多國家引起家禽的發病和死亡[1]。以前，人們認為鵝不會感染禽副黏病毒，國外至今未見禽副黏病毒感染鵝的報道[2]。1997年揚州大學王永坤教授在江蘇省首次發現該病[3]，并做了流行病學調查：該病對所有年齡段的鵝都造成傷害，死亡率和發病率跟年齡成反比，雛鵝發病后常引起死亡。該病主要通過呼吸道和消化道傳播，其流行沒有明顯的季節性，一年四季均可發生，常引起地方流行。

2019年1月甘肅某鵝場出現青年鵝不明原因死亡，死亡率約為40%，造成了嚴重的經濟損失。病鵝初期精神不振，縮頭垂翅，采食、飲水減少，拉白色水樣稀糞。走路時虛弱，拒絕入水，在水面上游泳，在地面總躺下。患病的成年鵝有時會將頭埋在翅膀下，常見口腔流出水樣液體。稍后階段，患病的鵝變得非常虛弱，渾身發抖，眼睛流淚，眼窩和周圍的羽毛被淚水打濕，鼻孔冒出來黃色黏液。死鵝整個消化道黏膜均有不同程度的腫脹、充血、出血等病變。初步懷疑是鵝副黏病毒感染。為了確診，采集病鵝、死鵝的脾臟和大腦，在實驗室進行病毒的分離和初步鑒定。

1 試驗材料

1.1 病料

病料采集于甘肅地區疑似鵝副黏病毒感染的鵝場。采集死鵝的脾臟、肝臟、肺臟和大腦，-20℃保存備用。

1.2 雞胚

9～11日齡非新城疫免疫雞胚，由楊凌綠方生物工程有限公司提供。

1.3 試驗動物

西北農林科技大學動物科學與技術學院實驗動物中心提供的健康雞。3日齡小公雞購自西北農林科技大學動物科技學院畜牧教學試驗基地種雞場。

1.4 試驗試劑及儀器

3.8%的枸櫞酸鈉，pH 7.2、0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（P B S）由甘肅農業大學動物醫學院實驗室配制。新城疫標準陽/陰性血清購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所。青霉素和鏈霉素由河北遠征藥業有限公司提供。

12#針頭，1 ml注射器，96孔聚乙烯塑料“V”型血凝反應板，微量移液器及槍頭，移液管，剪刀，鑷子，青霉素瓶，石蠟，酒精棉，照蛋器，離心管，離心機，37℃恒溫培養箱等。

2 試驗方法

2.1 1%雞紅細胞懸液的制備

首先，選取健康大公雞1只，翅靜脈采集抗凝血。其次，離心洗滌紅細胞。將采集的抗凝血放入離心管中，加入適量PBS洗滌液，1 500 r/min，離心10 min。反復離心洗滌3～5次。最后，配制1%紅細胞懸液。用移液管吸取洗滌后的紅細胞1 ml，加入99 ml PBS液中，4℃靜置保存備用。

2.2 病料處理

先取采集病鵝的脾臟、肝臟和大腦稱重，研磨，用PBS做1∶5稀釋，反復凍融3次以上。然后取凍融后液體，5 000 r/min離心15 min，取上清液加雙抗4℃作用6 h以上，加入的青霉素濃度為1 000 IU/ml，加入的鏈霉素濃度為1 000 μg/ml。最后取雙抗處理后的液體用0.22 μm微孔濾膜過濾，選取濾液，通過細菌學檢測為陰性，當作病毒分離液。

2.3 雞胚接種

從患病鵝中分離無菌病毒接種到10枚10日齡非新城疫免疫雞胚尿囊腔中，每胚接種0.2 ml，每12 h照蛋1次。

2.4 血凝試驗（HA）

在96孔聚乙烯塑料“V”型血凝反應板中進行。用微量移液器每孔加入50 μlpH 7.2、0.01 mol/L的PBS液，用微量移液器吸取收集的尿囊液50 μl，從第1孔起依次倍比稀釋，至第11孔棄去50 μl稀釋液。每孔加入50 μl1%雞紅細胞懸液，設立不加紅細胞的對照孔。把所加的液體搖勻后，將反應板置于37℃恒溫培養箱中培養，30 min左右觀察結果。血凝試驗操作術式見表1。

表1 血凝試驗操作術式

2.5 4單位抗原的配制

準備好配制4單位抗原所需的材料，包括病毒抗原、PBS緩沖液、1%雞紅細胞、單道和多道移液器及吸頭、20 ml青瓶及塞子、96孔微量血凝板等。

需要4單位抗原總量20 ml，利用公式（抗原原液×64（稀釋倍數）=20 ml）求出抗原原液的體積為0.312 ml，需要PBS緩沖液約19.7 ml。取PBS緩沖液19.7 ml，加入20 ml的小青瓶中，取0.312 ml的病毒抗原液，加入緩沖液中，蓋上塞子并充分混勻，4單位抗原配制完成。

2.6 血凝抑制試驗（HI）

在96孔聚乙烯塑料“V”型血凝反應板中進行。用加樣槍每孔加25 μl PBS稀釋液，取新城疫標準陽性血清25 μl，從第1孔起依次倍比稀釋，置第10孔棄取25 μl稀釋液。每孔再加入25 μl配制好的4單位抗原，加到第11孔。培養10 min后，最后每孔加入50 μl1%紅細胞懸液。將反應板置于37℃恒溫培養箱中，30 min左右觀察結果。血凝抑制試驗測定術式如表2所示。

表2 血凝抑制試驗測定術式

2.7 動物試驗

將收集的雞胚尿囊液肌肉注射給3日齡小公雞（10只），每只雞注射0.2 ml，設立對照組，共5只小公雞，每只肌肉注射0.2 ml無菌生理鹽水。飼養觀察。

3 結果與分析

雞胚接種情況和血凝試驗：10枚雞胚有1枚24 h內死亡，5枚雞胚48 h內死亡，剩余雞胚72 h全部死亡。收集雞胚的尿囊液并分裝做血凝試驗，血凝試驗結果如表3所示。

表3 血凝試驗結果

將收集的尿囊液配制4單位病毒抗原，血凝抑制試驗結果為4單位抗原的血凝性能被新城疫標準陽性血清所抑制。

接種尿囊液的小公雞于接種后48 h發病，72～120 h小公雞陸續死亡（72～98 h死亡約2/3，98～120 h死亡約1/3）。死亡小雞全身黏膜和漿膜出血，其中以呼吸道和消化道出血較為明顯，由小腸到盲腸和直腸黏膜有大小不等的出血點。腺胃黏膜水腫，其乳頭或乳頭間有出血點。心冠脂肪有針尖大的出血點，盲腸扁桃體出血。有神經癥狀的小雞剖檢可見腦膜充血或出血，腦實質無眼觀變化，類似于發病鵝的病理變化。對照組小雞無發病死亡情況。

由于血凝價均大于23，證明所分離的病毒有血凝性。4單位抗原的血凝性能被新城疫標準陽性血清所抑制，結果證明所分離的病毒為鵝副黏病毒。從動物試驗結果可以看出分，離出的病毒在雞中具有高致病性。

4 討論

國內外相關文獻資料表明，禽副黏病毒Ⅰ型不感染水禽，即使有病毒，但癥狀也不會表現得特別明顯。任濤[4]報告中說，新城疫毒力強的菌株已被用于抗擊28日齡的鵝，但它并未引起耐受鵝的疾病或死亡。自王永坤[5]教授于1997年報道鵝中存在副黏病毒以來，上海、吉林、黑龍江、江西、河南、安徽、貴州、遼寧、廣西、廣東、浙江等地區的鵝均已報告該病爆發流行。據有關資料報道，鵝副黏病毒病感染率為40%～100%，平均為60%，死亡率為30%～100%，平均為40%。其中，15日齡雛鵝的發病率和死亡率均為100%。患病鵝群年齡越小，發病率和死亡率就越高。鵝副黏病毒病的流行已對鵝產業造成了巨大破壞，并嚴重威脅著鵝產業的快速發展。

近年來，隨著養殖業的發展，鵝副黏病毒病在規模化養鵝場普遍存在[6]。本次試驗所采集的病料來自一個養殖數量約30 000只的鵝場。試驗用非新城疫免疫雞胚從采集的病料中分離到了病毒。分離毒株傳代的雞胚尿囊液具有較高的HA效價，并且能被新城疫標準陽性血清抑制，不能被新城疫陰性血清抑制，說明分離的病毒為鵝副黏病毒。

根據試驗結果，建議鵝場立即采用鵝副黏病毒高免血清對鵝群進行緊急預防治療，對病情嚴重的鵝及早淘汰。鵝場連夜從成都空運鵝副黏病毒高免血清對鵝進行治療，治療第2天鵝發病數量明顯減少，1周后鵝場沒有鵝再發病和死亡。治療結果又證明了所分離的病毒為鵝副黏病毒。

鵝場如果出現類似癥狀的鵝應先確診。確診后立即將沒有出現癥狀的鵝隔離出飼養場地，除了處理死鵝并對其進行無害化處理以及對家庭和設備進行徹底消毒外，還必須采取以下步驟：幼鵝、青年鵝、成年鵝肌肉內或皮下注射滅活疫苗。通常接種疫苗1周可控制發病率和死亡率，注射滅活疫苗1個月后可以使用疫苗的射油乳劑進行免疫[7]。可以給鵝注射高免疫血清或高免疫蛋黃，但在6～7 d左右應注射油乳劑滅活苗免疫。在應用疫苗或抗體免疫時可以適量應用廣譜抗生素和維生素。