銀杏葉提取物EGb-761 對(duì)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移型小鼠體內(nèi)實(shí)體瘤的影響

劉培培，馮趙慧子，嚴(yán)金玲，曾雪亮，潘靜，高暢

1.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000；2.贛州市人民醫(yī)院，江西 贛州 341000

乳腺癌是產(chǎn)生于乳腺和導(dǎo)管中的惡性腫瘤，是女性最常見(jiàn)的腫瘤。近年來(lái)，乳腺癌的發(fā)病率逐漸上升，對(duì)女性健康有很大的威脅［1-2］。乳腺癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因；乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的防治是目前乳腺癌的主要靶點(diǎn)和困難之一。目前，對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的治療沒(méi)有明顯的突破，主要用手術(shù)治療、化療來(lái)防止復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，然而，化療具有強(qiáng)烈的毒性，有時(shí)甚至加速腫瘤的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移。因此，尋找一種既能預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，又能減少放化療毒副作用的抗癌藥物迫在眉睫。銀杏是新生代第四紀(jì)冰川期的殘遺植物。世界上超過(guò)70%的銀杏樹(shù)在我國(guó)生長(zhǎng)。EGb-761 是從名貴中藥銀杏葉中提取的有效活性成分，主要用于治療認(rèn)知障礙、血管疾病、腫瘤等等［3-6］。但關(guān)于其對(duì)乳腺癌實(shí)體瘤影響作用的研究和乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本文旨在研究EGb-761 是否對(duì)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移型小鼠體內(nèi)實(shí)體瘤有影響。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取8 周齡健康清潔級(jí)雌性BALB/c 小鼠40只，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（渝）2002007］，自適應(yīng)喂養(yǎng)1 周后開(kāi)始試驗(yàn)。將小鼠隨機(jī)分為五組，即正常組、模型組、EGb-761 組［高劑量組（200 mg/kg）、中劑量組（100 mg/kg）、低劑量組（50 mg/kg）］，每組8 只。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

取銀杏葉粉碎，加乙醇在70 ℃左右的環(huán)境中浸提；再加入用酸調(diào)節(jié)后的乙醇，過(guò)濾、沉淀濃縮液稀釋冷卻至-1 ℃～20 ℃沉降；上清液用苯乙烯形大孔吸附樹(shù)脂柱吸附，然后洗脫；洗脫液通過(guò)DAD-1 吸附，以提取酸樹(shù)脂柱；流出液和洗脫液濃縮干燥，以備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

銀杏葉（當(dāng)?shù)刂兴幍辏⒁掖迹ㄉ虾Ｉど锕こ坦煞萦邢薰荆?、苯乙烯（Sigma-Aldrich 公司）、培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司）、FBS 緩沖液（Becton-Dickinson 公司）、游標(biāo)卡尺（南京智睿生物科技有限公司）、天平（海天美天平儀器有限公司）、福爾馬林溶液（北京百諾威生物科技有限公司）、解剖顯微鏡（德國(guó)Zeiss 公司）、EP 管、離心管（美國(guó)Corning 公司）、異丙醇（北京索萊寶科技有限公司）、離心機(jī)（北京白洋離心機(jī)有限責(zé)任公司）

1.4 方法

1.4.1造模于BALB/c 小鼠第二對(duì)乳房右側(cè)皮下接種為 2×105個(gè)/只的4T1 乳腺癌細(xì)胞，體積約0.1 mL/只，接種前混勻細(xì)胞懸液，于4 ℃條件下1 h內(nèi)完成。移植腫瘤細(xì)胞后的第7 天開(kāi)始，觸診每只造模小鼠注射細(xì)胞區(qū)域，以判斷原位腫瘤是否產(chǎn)生,小鼠飼養(yǎng)約30 d 后即可造成乳腺癌肺轉(zhuǎn)移，每日稱(chēng)量小鼠體質(zhì)量并記錄。

1.4.2觀察并測(cè)量各組小鼠原位灶實(shí)體瘤體積和小鼠體質(zhì)量各實(shí)驗(yàn)組在注射4T1 細(xì)胞24 h 后,計(jì)算實(shí)體瘤體積：每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量實(shí)體瘤的長(zhǎng)、寬，并計(jì)算實(shí)體瘤體積（cm3）=（長(zhǎng)×寬2）/2；計(jì)算實(shí)體瘤質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量：取處死后的小鼠原發(fā)灶腫瘤，用天平稱(chēng)取實(shí)體瘤重，并計(jì)算小鼠體質(zhì)量。

1.4.3觀察并計(jì)算各組小鼠肺部轉(zhuǎn)移灶結(jié)節(jié)數(shù)、轉(zhuǎn)移率摘取各組小鼠肺部組織，將其放入福爾馬林溶液中浸泡 1 個(gè)月后，在解剖顯微鏡下觀察并計(jì)算其表面腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)。轉(zhuǎn)移率=模型組中已轉(zhuǎn)移的動(dòng)物數(shù)量（只）/模型組動(dòng)物總數(shù)（只）×100%

1.4.4RT-PCR 法檢測(cè)各組小鼠CK-19 mRNA 表達(dá)將肺組織研磨后將組織轉(zhuǎn)移到EP 管；然后，在4 ℃下，以12 000 g 的速率離心15 min，得到上清液；然后加入異丙醇0.7 mL，混勻，室溫10 min；加1.4 mL 75%乙醇混勻；4 ℃，7 000 g 離心5 min，丟棄，在室溫下干燥5 min；DEPC 處理滅菌純水100 μL 溶解，-80 ℃保存，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 21.0 軟件。計(jì)量資料以表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠原位灶實(shí)體瘤體積和小鼠體質(zhì)量比較

各組小鼠原位灶實(shí)體瘤體積和小鼠體質(zhì)量比較結(jié)果見(jiàn)表1，EGb-761 低、中、高劑量組實(shí)體瘤體積均低于模型組，且隨著EGb-761 劑量的增加，體積越來(lái)越??；EGb-761 低和中、高劑量組的體質(zhì)量均高于模型組，隨著EGb-761 劑量的增加，實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量呈增加趨勢(shì)，與模型組比較，中、高劑量組體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組小鼠原位灶實(shí)體瘤體積和小鼠體質(zhì)量比較（）

表1 各組小鼠原位灶實(shí)體瘤體積和小鼠體質(zhì)量比較（）

注：與模型組比較，aP＜0.05。

2.2 各組小鼠肺部轉(zhuǎn)移灶結(jié)節(jié)數(shù)、轉(zhuǎn)移率比較

各組小鼠肺部轉(zhuǎn)移灶結(jié)節(jié)數(shù)和轉(zhuǎn)移率比較結(jié)果如表2，EGb-761 低、中、高劑量組結(jié)節(jié)數(shù)均低于模型組，且隨著EGb-761 劑量的增加，肺部結(jié)節(jié)數(shù)也隨之減少，與模型組比較，各劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而隨著EGb-761 劑量的增加，肺轉(zhuǎn)移率隨之降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠肺部轉(zhuǎn)移灶結(jié)節(jié)數(shù)和肺轉(zhuǎn)移率比較（）

表2 各組小鼠肺部轉(zhuǎn)移灶結(jié)節(jié)數(shù)和肺轉(zhuǎn)移率比較（）

注：與模型組比較，aP＜0.05。

2.3 各組小鼠CK-19mRNA 表達(dá)比較

各組小鼠CK-19mRNA 表達(dá)比較結(jié)果見(jiàn)表3，EGb-761 低、中、高劑量組分別低于模型組，且隨著EGb-761 劑量的增加，各劑量組小鼠肺CK-19 mRNA 表達(dá)量越低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組小鼠CK-19mRNA表達(dá)比較（）

表3 各組小鼠CK-19mRNA表達(dá)比較（）

注：與模型組比較，aP＜0.05。

3 討論

EGb-761 的提取工藝已非常成熟，國(guó)際上常以德國(guó)生產(chǎn)工藝為參照標(biāo)準(zhǔn)。銀杏葉提取物含有黃酮類(lèi)化合物、烯醇類(lèi)、酚類(lèi)、糖類(lèi)等活性成分，國(guó)內(nèi)外均有研究表明EGb-761 具有顯著抗腫瘤作用［7-8］，其中關(guān)于抗乳腺癌作用方面亦有報(bào)道［9-10］。乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程可以大致分為三個(gè)階段:附著力、入侵和遷移。在體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤向淋巴道和肺組織轉(zhuǎn)移多見(jiàn)，如乳腺癌則常向同側(cè)腋窩淋巴結(jié)或肺部轉(zhuǎn)移，造成原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶均有腫瘤或結(jié)節(jié)產(chǎn)生。4T1 細(xì)胞是一類(lèi)從BALB/c 小鼠乳腺癌細(xì)胞中分離出的細(xì)胞系，其在小鼠乳房皮下移植后，可形成腫瘤由原位自發(fā)地轉(zhuǎn)移至肺、肝、骨髓等器官，因此，實(shí)驗(yàn)研究時(shí)一般采用BALB/c 小鼠乳腺癌 4T1 高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株造成乳腺癌轉(zhuǎn)移模型。

在本研究中，EGb-761 低中高劑量組的體瘤體積均低于模型組，而小鼠體質(zhì)量均高于模型組，說(shuō)明造模成功；各組小鼠肺部轉(zhuǎn)移灶結(jié)節(jié)數(shù)和轉(zhuǎn)移率結(jié)果表明，隨著EGb-761 劑量的增加，肺部結(jié)節(jié)數(shù)隨之減少，肺部轉(zhuǎn)移率隨之降低。這說(shuō)明，EGb-761 對(duì)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移有抑制作用。有研究證實(shí)，由于CK-l9 在上皮細(xì)胞膜上表達(dá)，可以作為上皮細(xì)胞的標(biāo)志物，因此它在上皮起源的惡性腫瘤的早期血型轉(zhuǎn)移或微小轉(zhuǎn)移研究中運(yùn)用較多。肺部惡性腫瘤無(wú)論是鱗癌還是腺癌均起源于肺泡上皮細(xì)胞，其CK-l9 均有廣泛表達(dá)，所以在肺癌患者的血中檢測(cè)CK-l9mRNA 或CK-l9 蛋白的表達(dá)可以監(jiān)測(cè)和評(píng)估是否存在潛在的肺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)或腫瘤有無(wú)復(fù)發(fā)［11］。在本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，EGb-761 低、中、高劑量組的CK-19mRNA 表達(dá)量均低于模型組，且隨著EGb-761 劑量的增加，CK-19mRNA 表達(dá)量越低。因此推測(cè)，EGb-761 可能通過(guò)影響CK-19mRNA 表達(dá)來(lái)抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移。

綜上所述，推測(cè)銀杏葉提取物（EGb-761）可能通過(guò)影響CK-19mRNA 表達(dá)對(duì)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移型小鼠體內(nèi)實(shí)體瘤有抑制作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抗血管生成來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這為抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移提供了新的研究思路。