側柏葉、何首烏復合提取物防脫發功效研究

馬世宏，單承鶯，聶韡，束成杰

(南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 211110)

脫發是一種常見現象，分為生理性脫發和病理性脫發兩種。生理性脫發指頭發正常的脫落，而病理性脫發則是一種常見的毛發疾病。據不完全統計，目前中國約有2.5億脫發人群，其中男女比例約為3∶2，且脫發群體的年輕化趨勢越發明顯[1]。脫發雖不屬于嚴重疾病，但對人們的精神狀態和心理健康會產生較大的影響。雄激素源脫發(Androgenetic Alopecia，AGA)是脫發常見的誘因之一，以頭皮油膩、瘙癢、頭屑增多、脫發等為主要表現，男女均會發生；其發病機制與雄激素分泌、遺傳以及精神緊張、疲勞、熬夜等不良生活習慣有關，其中雄激素為主要誘因[2]。頭部毛發生長嚴格地受雄激素的影響，雄性激素中的睪酮在毛囊處經5α-還原酶催化，變成活性更高的5α-二氫睪酮(DHT)，并且這種變化是不可逆的。DHT是引起脫發的重要原因，它能與毛囊細胞內特定受體蛋白結合，將特定基因活化，誘導生成特定蛋白質，從而阻礙毛發生長，進而產生永久性脫發[3]。

側柏葉是柏科植物側柏(Platycladusorientalis(L.) Franco)的干燥嫩枝葉，作為一味常見中藥可用于治療脫發。《中華本草》中有記載，用側柏葉乙醇提取物涂擦毛發脫落部位，治療160例，總有效率達77.5%[4]。這類傳統中醫藥方或偏方中，一般采用外部涂抹等手段，通過促進頭皮部位血液微循環，增加細胞養分、刺激毛囊生長等手段，達到治療脫發的作用。近年來，已有不少相關報道以側柏葉及其他藥材作為復方制劑在治療脫發方面的研究[5-7]，但對于其作用機理仍然少有報道。

何首烏為蓼科植物何首烏(PolygonummultiflorumThunb.)的干燥塊根，自古有“烏須發”的功效，歷來為治療白發與脫發的重要藥物。載自《積善堂方》的七寶美髯丹即含有何首烏[8]。有學者研究發現首烏生發丸治療白發與脫發的療效優于101章光生發液，并且無明顯毒副作用[9]。有報道以首烏生發顆粒治療斑禿、脂溢性脫發患者，總有效率97.6%，明顯優于同類臨床常用中成藥[10]。何紅梅等[11]研究指出何首烏提取物能誘導C57BL /6J 小鼠毛發生長，使毛囊細胞從休止期進入生長期，從而加速毛發生長。Zheng等[12]研究發現何首烏提取液能夠明顯促進體外培養的頭皮毛囊細胞的生長。

本文以側柏葉、何首烏為主要原料，參考傳統藥方制備其復合提取物，利用體外和體內試驗方法，對其防脫發功效進行評估并闡明其可能的作用機制，為后續開發含有側柏葉、何首烏成分的防脫生發個人護理產品提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL /6J 雄性小鼠(18-23 g)，SD雄性大鼠(250-300 g)，均為SPF 級，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SYXK(滬)2017-0003。試驗動物由本單位動物實驗室飼養，飼喂常規飼料及飲用水，5～7 d待小鼠適應后，開始試驗操作。

側柏葉、何首烏生藥材(南京先聲藥業有限公司)；米諾地爾搽劑(有效成分含量2%，四川美大康華康藥業有限公司)；非那雄胺片(杭州默沙東制藥有限公司)；睪酮、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(美國Sigma公司)；NADPH、丙基羥苯酸酯、甲醇(色譜純)、二氯甲烷(色譜純)(國藥集團化學試劑有限公司)；丙酸睪酮注射液(寧波第二激素廠)；注射用大豆油(鐵嶺北亞藥用油有限公司)；小鼠睪酮酶聯免疫檢測試劑盒、小鼠雌二醇酶聯免疫檢測試劑盒(南京生物工程研究所)。

紫外分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；冷凍低溫離心機(美國Thermo Fisher公司)；高效液相色譜儀(美國安捷倫Agilen公司)；酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；旋轉蒸發儀(北京大龍RE100-Pro)。

1.2 試驗方法

1.2.1 側柏葉、何首烏復合提取物的制備

取干燥的側柏葉、何首烏藥材，粉碎，過20目篩，按質量比1∶1分別準確稱取100 g，按照1∶15的料液比加入3000 g 濃度為50%(V/V)的乙醇溶液，加熱回流提取3～4 h，趁熱過濾，將收集的濾液用旋轉蒸發儀減壓濃縮至浸膏狀，干燥稱重，得76.44 g 復合提取物；將此提取物復溶于去離子水，配置成質量濃度200 mg/mL 的溶液，離心后取上清液經膜過濾，即得側柏葉、何首烏復合提取物受試液母液，冷藏備用。

1.2.2 清除DPPH自由基試驗

將DPPH配制成0.2 mmol /L溶液(即配即用)，然后吸取250 μL受試溶液于eppendorf管中，加入750 μL DPPH溶液，于室溫下黑暗處反應，時間分別設定為30 min、60 min，于517 nm處測定光吸收值(A值)，n=3。

DPPH自由基清除率=1-(A樣品-A空白)/A對照×100%

1.2.3 體外5α-還原酶抑制試驗[13]

5α-還原酶的制備：取SD雄性大鼠6只，禁食12 h后處死，于低溫解剖臺上取出大鼠前列腺，剪碎并稱重。按質量比1∶5的比例加入提前預冷的緩沖液(含0.32 mol/L蔗糖、0.1 mmol/L 二硫蘇糖醇、1 mmol/L乙二胺四乙酸和0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液)，于勻漿器中快速制成勻漿，使用冷凍離心機離心(13000 r/min，10 min)，取離心后上清液(須棄去最上層脂肪層)，加入緩沖液定容至20 mL，分裝至eppendorf管中，于-80 ℃冰箱中保存備用。

5α-還原酶活性測定：依次加入0.5 mL磷酸鹽緩沖液、0.2 mL受試溶液、200 μL睪酮溶液(300 mg/L)和200 μL NADPH溶液(0.8 g/L)于具塞試管中，最后加入0.5 mL 5α-還原酶提取物，于37℃下反應30 min；反應結束后加入3 mL二氯甲烷停止反應并萃取睪酮，再加入0.25 mL丙基羥苯酸酯(100 mg/L)作為內標，離心(5000 r/min，10 min)。棄去上層水相，移取約1 mL有機相，蒸干，將殘留物溶于1.5 mL甲醇中，吸取10 μL用高效液相法測定殘留睪酮含量。陽性對照為0.05 mg/L非那雄胺組，同時設定5α-還原酶反應管和5α-還原酶空白管。

5α-還原酶抑制率=(R樣品-R反應)/(R空白-R反應)×100%

式中，R為目標峰面積與內標峰面積之比。

1.2.4 小鼠防脫發試驗

1.2.4.1 動物造模及分組給藥[14]

按照試驗設計，將60只C57BL /6J小鼠隨機分為6組，分別為正常組、模型組、陽性組以及復合提取物高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組各10只。試驗前將丙酸睪酮注射液和注射用大豆油按1∶5(V/V)進行稀釋，配制成濃度為5 g /L的丙酸睪酮溶液備用；正常組小鼠在身體背部皮下注射注射用大豆油，每日1次；其余各組在小鼠身體背部皮下均注射丙酸睪酮溶液造模，劑量為5 mg /(kg·d)。造模同時各組小鼠背部毛發區給予相應受試液涂抹：陽性組給予米諾地爾搽劑0.3 mL涂抹；復合提取物高、中、低劑量組給予質量濃度40、100 、200 mg/mL的復合提取物溶液0.3 mL涂抹；正常組及模型組給予0.3 mL蒸餾水涂抹，注射丙酸睪酮溶液和涂抹給藥須連續進行10 w。

1.2.4.2 觀察指標及測定結果

小鼠狀態及脫發情況觀察：觀察各時間段各組小鼠的常規狀態。從第5 w開始至試驗結束，每天收集各組小鼠脫落毛發；在固定時間段用相同篦子梳理每只小鼠背部的毛發，脫落的毛發用鑷子收集并稱重，用于小鼠脫發程度的考察。

小鼠血清中睪酮、雌二醇的測定：試驗10 W后，所有受試小鼠眼眶后取血， 4℃下離心(13000 r/min，10 min)，獲取血清后分裝，置于-80℃冰箱備用。使用ELISA試劑盒測定小鼠血清中睪酮、雌二醇含量(按試劑盒要求操作)。

所有試驗數據均采用SPSS統計軟件進行統計學分析，每兩組間數據比較采用t檢驗，P<0. 05 為差異具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 抗氧化測試

將側柏葉、何首烏復合提取物母液，按照質量濃度梯度配置為4、20、40、100、200 mg/mL的受試液，DPPH自由基清除結果見圖1。由圖1可以看出，受試液在反應維持30 min和60 min 時，均具有明顯的自由基清除率，且效果隨受試液濃度增加而增加，呈現出明顯劑量效應關系；同一質量濃度下，反應60 min 時清除效果優于30 min。

有研究表明側柏葉提取物、何首烏提取物都具有一定的抗氧化能力[3,7]。本研究在 DPPH 自由基清除試驗中，側柏葉、何首烏復合提取液也顯示出較強的抗氧化能力，并且兩者之間可能產生了一定的協同增效作用。生發與脫發過程是頭皮細胞被氧化與抗氧化程度動態平衡的結果，一方面，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)有促進毛囊細胞增殖的作用[15]；另一方面，氧化應激反應又被認為是導致心理性脫發的主要原因之一[16]。DPPH自由基清除率是一種被廣泛認可的物質抗氧化能力的評價指標。本試驗結果顯示側柏葉、何首烏復合提取物在不同作用時長下，DPPH的清除率均隨溶液質量濃度增加而升高，表明該復合提取物具有較好的抗氧化能力。

圖1 不同質量濃度受試液對 DPPH 自由基清除率Fig.1 DPPH scavenge of samples with different concentration

2.2 對5α-還原酶的抑制作用

將側柏葉、何首烏復合提取物母液按照質量濃度梯度配置為4、20、40、100 mg/mL的受試液。試驗結果表明，不同質量濃度的受試液對5α-還原酶活性均表現出一定的抑制作用，且具有出明顯的劑量效應關系，隨受試液質量濃度升高其抑制率也隨之升高。在100 mg/mL質量濃度下，抑制率達到52.74%，陽性對照非那雄胺(0.05 mg/L)表現出極高的抑制率(91.47%)，因為非那雄胺是一種公認的5α-還原酶的競爭型抑制劑。結果見圖2。

圖2 樣品對 5α-還原酶的抑制效果Fig. 2 Inhibition of 5α-reductase activity

有相關研究表明，現有脫發人群中約九成屬于雄激素源性脫發。陽性對照藥物非那雄胺為一種甾體類固醇，其作為II型5α-還原酶抑制劑可以有效抑制血液循環，抑制頭部皮膚毛囊內睪酮向二氫睪酮轉換這一過程，從而達到治療脫發的目的，是目前國內外治療雄激素源脫發的一線用藥[2,7]。

體外試驗結果表明，受試液樣品在4、20、40、100 mg/mL質量濃度下對5α-還原酶活性均具有抑制作用，抑制率分別為6.86%、14.39%、22.51%和52.74%。雖然效果不如陽性對照非那雄胺顯著，但在100 mg/mL質量濃度下抑制率也能超過50%，可推測本受試液在體外也具有抑制雄性激素脫發的作用。

2.3 小鼠防脫發試驗

2.3.1 一般狀態觀察

造模組小鼠注射丙酸睪酮溶液后，有些小鼠出現躁動現象并互相廝打。2 w后，小鼠毛發順滑程度下降；4～5 w后，小鼠背部毛發逐漸干枯失去光澤，7 w左右小鼠逐漸出現背部毛發脫落現象。側柏葉、何首烏復合提取物溶液高、中劑量組比模型組脫落現象有改善，尤以高劑量組較為明顯。各組小鼠毛發脫落情況比較見圖3及表1。

圖3 各組小鼠實驗照片Fig. 3 Mice anti-hair loss experiment photos注：a-正常組，b-模型組，c-陽性組，d-低劑量組，e-中劑量組，f-高劑量組

2.3.2 血清睪酮、雌二醇

測定結果見表2。

表1 小鼠脫毛重量

表2 小鼠血清 T、E2 含量

雄激素在毛發生長過程中起到重要作用，能夠促進毛發由新生狀態向成熟狀態轉化。已有研究指出，雄激素如果異常增多，會導致 T /E2 比例失調，從而導致雄激素源性脫發(AGA )疾病的發生[17]。通過本試驗研究，發現該復合提取物可降低體內睪酮含量，這與其具有抑制5α-還原酶活性也符合，提示了其可能的作用機理，進而推測該復合提取物應用于人體也具有防脫作用。

AGA發病率較高且發病機制仍未完全明確，本試驗采用的AGA鼠類模型，是目前較受認可的一個動物模型，具有較明顯的優勢。其一，該造模過程與AGA的病理生化改變過程相似。其二，小鼠基因組與人類高度接近，毛發生長變化周期與人類也相似[18]；其三，C57BL/6J 小鼠毛發黑色，其顏色變化有利于判斷毛發的生長狀態，為動物實驗最常用的小鼠品系之一[19]。本試驗采用這種小鼠模型，結果表明側柏葉、何首烏復合提取物能明顯改善小鼠的脫發現象。

本團隊的早期試驗結果表明側柏葉醇提物和揮發油可以適當延緩脫毛，對小鼠化療性毛囊損傷具有一定的保護作用并能有效改善其脫發現象[5]；還有相關研究則表明側柏葉醇提物對防治脂溢性脫發也具有一定的效果[20]，而本試驗結果則表明側柏葉、何首烏復合醇提取物具有明顯的5α-還原酶抑制活性，能顯著改善小鼠雄激素源性脫發。

3 結 論

本文采用體外和體內試驗對側柏葉、何首烏復合醇提取物的防脫發功效進行評價，試驗證明了該復合提取物具有清除DPPH自由基從而起到抗氧化的作用；在體外具有抑制5α-還原酶活性，且AGA小鼠模型試驗表明其可以顯著改善 C57BL/6小鼠雄激素源性脫發現象。

采用中國傳統藥用植物治療脫發具有全面兼顧、副作用小、消費者接受程度高等優勢；本試驗通過體外和體內試驗結果充分證明了側柏葉、何首烏復合醇提取物具有明確的防治雄激素源性脫發功效，且提示了其發揮作用的可能機理與抑制5α-還原酶活性有關。該提取物可應用于研發更安全更有效的防脫生發相關個人護理類日化產品，具有廣闊的市場前景。