基于網絡藥理學的枇杷葉抗肺纖維化機制研究

黃 靖，楊 磊，林大河，林素英，林海燕，包君麗*

(1. 莆田學院 環境與生物工程學院 福建省新型污染物生態毒理效應與控制重點實驗室，福建 莆田 351100； 2. 青海大學 醫學院，青海 西寧 810016)

肺纖維化(Pulmonary fibrosis, PF)是以成纖維細胞增殖及大量細胞外基質聚集并伴炎癥損傷、組織結構破壞為特征的一大類肺疾病終末期改變[1]。肺纖維化的病因主要分為兩類，一類為已知原因，主要為職業與環境吸入疾病，包括吸入無機粉塵、有機粉塵和各種刺激性有毒氣體；另一類為未知原因，這組疾病稱為特發性間質性肺炎，是間質性肺病中一大類[2]。肺纖維化嚴重影響人體呼吸功能，表現為干咳、進行性呼吸困難，且隨著病情和肺部損傷加重，患者呼吸功能不斷惡化[3]。肺纖維化發病率和死亡率逐年增加，診斷后的平均生存期僅2.8年，死亡率高于大多數腫瘤，被稱為一“類腫瘤疾病”[4]。鑒于肺纖維化發病機制尚未完全明確，目前臨床上尚無針對性西醫藥物[5]。

中醫近年在治療肺纖維化方面形成了自己的一些特點，也取得了一定的的成果[6]。中醫古代文獻中雖無與肺纖維化相對應的病名記載，但根據其臨床表現可歸為“肺痿”和“肺痹”范疇[7]。枇杷葉是治療呼吸道炎癥性疾病的常見中藥材之一，具有悠久的歷史。近些年來，枇杷葉在改善肺纖維化癥狀上療效顯著[8]。然而，目前枇杷葉對肺纖維化的相關作用機制尚未明確，使得臨床作用的發揮具有很大局限性。

中藥化學成分多、方劑中多種中藥相互作用、實驗周期長、工作量大，而且不能全面地進行靶標測試，無法系統地從化合物成分-靶點去驗證。網絡藥理學是基于系統生物學，通過大數據挖掘的方法，對藥物進行多成分、多靶點、多途徑的網絡作用關系分析，從科學、全面的角度分析藥物治療疾病的作用機制，為中醫藥的研究及應用提供方向[9]。分子對接是通過受體的特征以及受體和藥物分子之間的相互作用方式來進行藥物設計的方法，主要研究分子間(如配體和受體)相互作用，并預測其結合模式和親合力的一種理論模擬方法[10]。

本研究運用網絡藥理學的方法篩選枇杷葉有效活性成分，預測治療肺纖維化相關靶標和通路，構建“疾病-藥物-成分-靶標”網絡圖，全面分析探討枇杷葉治療肺纖維化的可能作用機制，再利用分子對接技術對枇杷葉中活性成分與肺纖維化關鍵靶標蛋白進行模擬結合研究。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分的收集

為收集枇杷葉的化合物成分，利用中藥系統藥理數據庫和分析平臺(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/TCMSP.php)[11]，以“枇杷葉”為關鍵詞在“Herb name”條目中檢索其化學成分，根據藥物化合物分子的ADME參數分析，結合到后期用藥量化分析，設定口服生物利用度(Oral bio- availability，OB)≥30%，成藥相似性(Drug Like，DL)≥0.18，篩選獲得初步滿足網絡藥理數據分析標準的化合物分子。

1.2 活性成分候選靶標對應基因的收集

為了收集枇杷葉主要化合物的相應靶點，采用了以下方法。首先，查詢由TCMSP數據庫所提供的潛在作用靶點蛋白全稱，然后借助Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)[12]對潛在靶點進行基因名稱的注釋；同時將枇杷葉的潛在化合物分子按照名稱通過Stitch數據庫(http://Stitch.embl.de/，ver)[13]查詢與其對應的靶點基因；下載由TCMSP查詢得到的化合物分子MOL2的格式文件，依次輸入到Swiss target prediction 數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)[14]查詢相應靶點，最后將以上數據庫查詢結果整理合并，盡最大可能確保數據的完整性。

1.3 肺纖維化相關靶標基因的收集

檢索人類基因組注釋(Genecards)數據庫(https://www.genecards.org/)[15]和《人類孟德爾遺傳》(OMIN)數據庫(https://omim.org/)[16]，以“pulmonary fibrosis”為關鍵詞，將得到的疾病相關基因進行整理，作為肺纖維化疾病相關基因。

1.4 活性成分-作用靶標網絡構建與分析

剔除掉重復及與疾病沒有相關性的靶點，再將剩余的藥物活性成分與肺纖維化治療作用靶標及相關通路構建相應的數據表，以構建的關系數據表作為Cytoscape 3.7.2的輸入文件構建化合物成分及潛在作用靶點網絡圖，展示藥物活性成分與作用肺纖維化靶標間的作用關系。

1.5 靶蛋白互相作用網絡圖構建

將枇杷葉治療肺纖維化的潛在作用靶標導入String數據庫(https://string-db.org/)[17]，限制物種為“Homo sapiens”，獲取蛋白互作關系，以“TSV”格式導出結果。將所得數據導入 Cytoscape3.7.2 軟件進行可視化處理，通過Network analyzer工具進行網絡分析從而獲得 Degree值，繪制蛋白互作(Protein-protein interaction，PPI)網絡圖，并以PNG格式導出。

1.6 基因本體富集(Gene ontology，GO)及特定物種種屬代謝通路 (Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析

將枇杷葉治療肺纖維化潛在作用靶標基因利用R語言的Clusterprofile程序包進行GO基因富集分析和KEGG通路富集分析，設定P_Value≤0.05得到相應的生物學過程及KEGG通路相關數據，然后將所得KEGG數據導入Cytoscape 3.7.2進行可視化圖形繪制。

1.7 分子對接

從PDB蛋白質數據庫(http://www.pdb.org/)下載枇杷葉重要化合物結合的候選蛋白質的晶體結構，并用MOE軟件進行修飾，以去除配體、添加氫、去除水、優化和修補氨基酸，并使所有候選靶點的能量最小化。我們使用MOE來測試枇杷葉化合物與候選靶蛋白之間的對接精度，因為它具有較高的準確性和一致性。整體評估的最終得分是E_score = 2，對應的數值越小，分子之間的結合能越小，這意味著兩者之間有較好的結合性(一般小于-5)。同時，用不同的顏色標記小分子的結構，我們可以觀察到兩者之間的結構空間有較大的重復區域，這證明了小分子構象與配體之間有很大的相似性。

2 結 果

2.1 枇杷葉選活性成分及候選靶標

通過TCMSP數據庫檢索得到枇杷葉活性成分共304個，再根據藥物動力學特點設定閾值OB≥30%，DL≥0.18后，篩選出枇杷葉候選成分18個(見表1)，同時在平臺檢索這些候選活性成分的靶標，共134個。由Swiss Target Prediction數據庫獲取的靶標共有560個，篩選Probability大于0后共351個。將兩個數據庫搜索得到的靶標匯總去重后共有靶標464個。

表1 枇杷葉候選活性成分

續表1 枇杷葉候選活性成分

2.2 藥物活性成分治療肺纖維化候選靶標預測

人類基因組注釋數據庫中肺纖維化相關基因786個，OMIM數據庫所得肺纖維化相關基因218個，去重后共得肺纖維化相關基因960個。再將藥物候選基因與肺纖維化相關基因取交集，獲得可能與肺纖維化有關作用靶標103個。篩選過程見圖1。

2.3 藥物-化合物-疾病-靶標-通路網絡構建

將枇杷葉活性成分和與肺纖維化的作用靶標導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建藥物-化合物-疾病-靶標-通路網絡圖。所構建網絡共包括152個節點，其中18個活性成分節點，103個作用靶標節點，2286條邊線。通過圖2可以看出枇杷葉主要通過多成分對應多靶標來發揮對肺纖維化治療作用。

2.4 靶蛋白互作網絡圖

將枇杷葉治療肺纖維化潛在作用靶標基因導入String蛋白互作網絡數據庫獲取靶標蛋白互作關系圖，將其導入Cytoscape 3.7.2軟件，菜單欄選擇tools，然后運用analysis network，配置節點大小和顏色以跟隨degree進行連續性變化，再配置邊的顏色和粗細跟隨combine_score進行連續性變化，最后根據節點度數將靶基因布局為四個同心圓，最外圍的節點度數小于20，第三層的靶基因節點度數介于20-39，第二層的靶基因節點度數介于40-59，最里層的節點度數大于等于60。此網絡圖共包括103個節點，1463條邊，圖中 Degree 越大則節點越大，顏色越深，根據靶蛋白互作網絡圖計算得出相關節點度數的平均值為31，選取節點度數大于31的靶點(共計42個)作為重點研究，如AKT1、VEGFA、IL6、EGFR、CASP3等，可認為這些個靶標與枇杷葉治療肺纖維化相關性較大，見圖3。

圖1 枇杷葉作用肺纖維化靶點篩選Fig. 1 The target genes of pulmonary fibrosis on the treatment by E. japonica

圖2 藥物-化合物-疾病-靶點網絡圖Fig. 2 Compounds-disease targets-mechanism network

圖3 靶蛋白互作網絡Fig. 3 Drug Target Protein-Protein Interaction Networks

2.5 枇杷葉中活性成分對應潛在靶標基因生物功能及通路分析

GO富集分析結果顯示：① 生物過程(Biological process，BP)分析富集基因數量較大的有活性氧代謝過程、活性氧代謝過程的正調控、活性氧代謝過程的調控、MAP激酶活性的調節對氧氣水平的反應等(圖4)，②細胞分組(Cellular component，CC)分析中富集基因數量較大的有膜筏、膜微區、膜區等(圖 5)，③分子功能(Molecular function，MF)分析富集基因數量較大的有蛋白酪氨酸激酶活性胰島素受體底物結合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性絲氨酸型內肽酶活性等(圖6)。KEGG通路富集分析結果顯示，共138條通絡(P_Value<0.05)，如AGE-RAGE信號通路、膀胱癌、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)等(圖7)。

2.6 分子對接

為了驗證肺纖維化中枇杷葉靶點的候選化合物，測試了23-trans-p-coumaryhormentic acid和以下潛在靶蛋白: EGFR(PDB：2JIV)、MMP2(PDB：4KWE)和MMP9(PDB：6ESM)之間的對接精度(圖8)。對接分析結果表明，靶蛋白和對應的化合物分子的得分小于-5，表明靶蛋白和化合物分子之間有較好的結合性(表2)。

圖4 生物過程分析Fig. 4 The BP analysis

圖5 細胞分組分析Fig. 5 The CC analysis

圖6 分子功能分析Fig. 6 The MF analysis

圖7 KEGG通路富集分析圖Fig. 7 KEGG pathway enrichment analysis diagram

圖8 23-trans-p-coumaryhormentic acid(MOL012556)與EGFR、MMP2和MMP9的分子對接Fig. 8 Molecular docking between 23-trans-p-coumaryhormentic acid(MOL012556) and (A) EGFR(B) MMP2(C)MMP9

表2 化合物-靶蛋白結合數據表

3 討 論

本研究結果顯示，枇杷葉作用于肺纖維化的有效活性成分18個，潛在作用靶標103個。根據這些靶標進一步收集枇杷葉治療肺纖維化的生物過程及富集通路，由此探究枇杷葉治療肺纖維化的作用機制，為其治療肺纖維化提供證據支持，更加有利于臨床的應用，也為進一步的試驗研究提供思路。

枇杷葉主要含有黃酮及其苷類化合物、三萜酸類化合物、有機酸類化合物、揮發油類化合物、無機元素及其他化合物[18]。已有報道表明，枇杷葉的主要活性成分枇杷葉三萜酸治療宮頸癌療效顯著[19]。劉娟等[20]研究發現枇杷葉三萜酸能明顯改善肺纖維化模型大鼠肺臟組織結構，減輕肺纖維化增生程度。楊雅茹等[21]的體外試驗發現枇杷葉三萜酸可能通過抑制ɑ-SMA基因表達來阻斷成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，可能通過降低Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、CTGF的過度表達，減少細胞外基質的沉積，也可能通過抑制ERK1/2蛋白磷酸化環節阻斷ERK通路等3個機制阻斷肺纖維化進程，發揮其抗肺纖維化的作用。黃艷等[22]的動物試驗發現葉三萜酸能明顯改善大鼠肺臟組織結構，減輕肺纖維化增生程度。

根據“靶蛋白互作網絡圖”以及文獻資料分析可得，復方苦參注射液治療宮頸癌可能通過作用白介素6(IL-6)、表皮生長因子受體(EGFR)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)等4個靶標來發揮作用。王書臣等[23]采用氣管內注入博萊霉素造成人鼠肺纖維化模型。試驗結果發現，模型組IL-6的濃度始終高于正常對照組及各治療組，肺纖平能降低血清IL-6的濃度，提示IL-6是肺纖維化的治療靶點。蔡琳等[24]的動物試驗結果發現，EGFR RNAi組與纖維化組比較，肺組織EGFR mRNA表達和EGFR蛋白表達均顯著下降；肺病理損傷較纖維化組減輕，肺羥脯氨酸含量顯著減少；磷酸化EGFR蛋白表達亦較纖維化組明顯減少，表明EGFR RNAi抑制了EGFR活化，減輕肺纖維化改變。任培中[25]動物試驗發現肺纖維化組較對照組肺組織MMP9表達水平明顯升高，中藥初期干預組MMP9表達水平明顯降低。王勇等[26]的動物試驗結果發現，纖維化模型組大鼠MMP2表達水平過高，雄附方高、中、低劑量組MMP2表達水平過低，提示MMP2可能是肺纖維化的治療靶點。

通過文獻檢索及KEGG通路富集分析可知，枇杷葉治療肺纖維化主要涉及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、表皮生長因子受體(EGFR)、核轉錄因子(NF-kappa B)、血管內皮生長因子(VEGF)和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)等信號通路。任培中等[27]的動物試驗結果表明通肺絡補宗氣方可通過調控mTOR/p70S6K信號通路來抑制肺成纖維細胞的增殖、生長，減少透明質酸、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原等細胞外基質的過度沉積，從而抑制肺纖維化的發生發展。楊偉源等[28]使用EGFR抑制劑吉非替尼對博來霉素所致小鼠肺纖維化進行干預，結果顯示吉非替尼可通過調控EGFR/Foxo3a/Snail1信號通路從而減輕小鼠肺纖維化，提示EGFR/Foxo3a/Snail1信號通路是治療肺纖維化的關鍵通路。楊善軍等[29]的動物試驗加味補陽還五湯可以調控NF-κB信號轉導通路來抑制肺纖維化，提示NF-κB信號轉導通路是治療肺纖維化的關鍵通路。欒智華等[30]的動物試驗結果表明黃芪甲苷可通過調控VEGF/VEGFR2信號通路來改善肺纖維化。張艷霞等[31]的動物試驗發現補氣活血通絡方通過干預PI3K/AKT信號通路的活化，從而起到對抗纖維化的作用。

本研究所獲取的枇杷葉治療肺纖維化的主要活性成分為三萜酸類化合物。分子對接結果表明23-trans-p-coumaryhormentic acid與IL6、EGFR、MMP9和MMP2有較好的結合性，這些結果提供了進一步的證據，證明這4種蛋白在肺纖維化中作為23-trans-p-coumaryhormentic acid的治療靶點。本研究這些靶蛋白是因為在PPI網絡圖中處于關鍵位置，同時它們參與了關鍵通路，結果提示它們在肺纖維化對化合物的反應中可能起關鍵作用。

4 結 論

本研究表明枇杷葉治療肺纖維化的主要活性成分為黃酮及其苷類化合物、三萜酸類化合物、有機酸類化合物、揮發油類化合物、無機元素及其他化合物。這些活性成分通過作用于IL-6、EGFR、MMP-9、MMP-2等靶標以及調節mTOR、EGFR、NF-kappa B、VEGF、PI3K-Akt等信號通路發揮對肺纖維化的治療作用從中可以看出枇杷葉治療肺纖維化具有多成分、多靶點、多通路的特點。然而本研究未能對其他治療肺纖維化的可能機制進行科學實驗的證實，尚存在局限性，但可以為有關試驗研究提供思路與方向。