瓜子金皂苷己通過SOCS3抑制氧糖剝奪/復氧所致小膠質細胞的炎癥反應*

高 燕，付旭陽，賀 帥，高 冰，石瑞麗，4

(1.包頭醫學院基礎醫學與法醫學院生理學教研室，內蒙古 包頭 014040；2.包頭醫學院神經科學研究所；3.包頭醫學院基礎醫學與法醫學院病理學教研室；4.內蒙古自治區低氧轉化醫學重點實驗室；5.達拉特旗人民醫院檢驗科)

腦卒中是常見的急性腦血管類疾病，其中缺血性卒中最為常見，其發病率、致殘率、致死率都較高，主要的藥物治療方法有溶栓治療、抗凝治療、抗血小板聚集治療、神經保護治療等。其中缺血后通過溶栓盡快恢復腦血流量是挽救尚未梗死腦組織的有效方法，但恢復血液灌注后會誘發更為嚴重的腦缺血再灌注(cerebral ischemia reperfusion，CIR)損傷。CIR損傷發生機制復雜，其中炎癥反應不僅在疾病發病期起重要作用，影響神經功能損害的程度[1]，也與疾病預后密切相關。過度和持續的炎癥反應不僅影響腦血管血流，而且可以直接破壞組織結構，造成缺血腦組織損傷。

CIR損傷發生時各種炎性細胞因子均需通過細胞信號轉導發揮效應，其中Janus 激酶/信號轉導與轉錄激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信號通路與CIR損傷存在密切關聯，是神經系統中重要的免疫反應及炎癥反應的經典途徑[2]。該通路的負反饋調控因子細胞因子信號抑制因子3(Suppressors of cytokine signaling3, SOCS3)在炎癥反應中被炎性細胞因子激活，可通過負反饋抑制JAK2/STAT3信號通路的激活從而減輕炎癥反應。SOCS3作為CIR損傷后的上調基因，可能參與了損傷后炎癥反應的調節與修復，也可能參與了腦細胞凋亡的調節過程，起到內源性神經保護的作用。

瓜子金皂苷己(Polygalasaponin F, PGSF)是從遠志科遠志屬植物瓜子金中提取的齊墩果烷型三萜皂苷類化合物，傳統醫學中主要用于散郁助眠、益智安神、解毒消腫。有研究發現PGSF可抑制LPS誘導的BV-2細胞炎癥模型中IL-1β的表達[3]。本課題組也在該模型中發現，PGSF可降低一氧化氮合酶和環氧合酶-2的蛋白及mRNA表達[4]。但PGSF對氧糖剝奪/復氧(Oxygen and glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)所致BV-2細胞激活分泌的作用及其作用機制，目前尚無報道。本研究擬在細胞水平應用OGD/R模型誘導BV-2小膠質細胞神經炎癥，以模擬腦缺血再灌注后炎癥反應，初步觀察PGSF能否降低炎癥因子的表達水平，該作用是否與SOCS3表達相關。通過實驗進一步明確PGSF的體外抗炎機制，為PGSF的開發應用提供實驗基礎和理論線索。

1 材料與方法

1.1實驗細胞 小鼠BV-2小膠質細胞瘤細胞，購自中國醫學科學院藥物研究所。

1.2試劑與儀器

1.2.1試劑 胎牛血清、高糖DMEM培養基購自Gibco公司，TRIZOL試劑購自thermo fisher公司，QPCR試劑盒購自上海海方生物技術有限公司。

1.2.2儀器 超速低溫冷凍離心機購自德國eppendorf公司，細胞缺氧試驗培養箱系統購自Billups-Rothenberg公司，熒光定量pCR儀購自ABI公司，酶標儀購自thermo fisher公司。

1.3實驗方法

1.3.1BV-2小膠質細胞培養及OGD/R模型的建立 將細胞置于含10 %胎牛血清和高糖DMEM的完全培養基中，于37 ℃、5 % CO2條件下培養，細胞長至70 %～80 %傳代，選擇對數生長期細胞進行實驗。將BV-2細胞以2.5×105個/孔的密度接種于6孔板，培養24 h后換為無糖eagle液，置于缺氧裝置中2 h。設置缺氧裝置氣體流量為20～25 L/min，持續充氮氣5 min后將細胞放入，取出后重新在完全培養基中于正常條件下培養以完成復氧復糖，6 h后收集細胞用于后續實驗。

1.3.2實驗分組及處理 細胞分為5組。(1)Control組：將培養基換為含糖eagle+葡萄糖溶液孵育2 h，之后換為完全培養基培養6 h；(2)OGD/R模型組：將培養基換為無糖eagle溶液后放入缺氧裝置中孵育2 h，之后換為完全培養基繼續培養6 h；(3)OGD/R+PGSF-L組：將培養基換為含PGSF(0.1 μmol/L)的無糖eagle溶液置缺氧裝置中2 h，再將孵育液換為含0.1 μmol/L PGSF的完全培養基繼續培養6 h；(4)OGD/R+PGSF-M組：與OGD/R+PGSF-L組相同處理，PGSF濃度為1.0 μmol/L；(5)OGD/R+PGSF-H組：與OGD/R+PGSF-L組相同處理，PGSF濃度為10.0 μmol/L。

1.3.3QPCR檢測基因表達 應用Trizol法提取細胞總RNA，根據反轉試劑盒說明書進行mRNA反轉錄，應用實時熒光定量多聚酶鏈式反應(Real-time Quantitative PCR，QPCR)擴增cDNA。擴增體系：預變性95 ℃ 10 min、95 ℃ 15s～60 ℃ 60 s循環40次、溶解曲線75 ℃～95 ℃，每20 s升溫1 ℃。結果處理采用ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待測樣本) - CT(內標基因，待測樣本)、B=CT(目的基因，對照樣本) - CT(內標基因，對照樣本)、K=A-B、表達倍數=2-K。引物設計根據GenBank已發表的基因序列，利用primer premier 5.0軟件設計NKCC1基因的pCR擴增引物，并同時設計內參β-actin基因擴增引物進行檢測。引物由上海生工公司合成，序列見表1。

表1 目的基因引物序列

2 結果

2.1PGSF對TNF-α基因表達的影響 與正常對照組比較，OGD/R損傷后模型組BV-2細胞的TNF-α基因出現高表達(P<0.05)；PGSF-L組、PGSF-M組、PGSF-H組TNF-α表達均明顯低于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。說明PGSF能夠降低OGD損傷后的TNF-α高表達，且呈濃度依賴性。見圖1。

圖1 PGSF對TNF-αmRNA表達的影響

2.2PGSF對IL-1β基因表達的影響 與正常對照組相比，OGD/R損傷后模型組BV-2細胞的IL-1β基因表達明顯升高(P<0.01)；PGSF-L組、PGSF-M組、PGSF-H組IL-1β表達均明顯低于模型組，差異具有統計學意義(P<0.01)。說明PGSF能夠降低OGD損傷后的IL-1β高表達的情況，且呈濃度依賴性。見圖2。

圖2 PGSF 對IL-1β mRNA 表達的影響

2.3PGSF對IL-6基因表達的影響 與正常對照組相比，模型組BV-2細胞的IL-6基因出現高表達(P<0.05)；PGSF-L組、PGSF-M組、PGSF-H組IL-6均明顯低于模型組，差異具有統計學意義(P<0.01)。結果說明PGSF能夠降低OGD損傷后的IL-6高表達的情況，且呈濃度依賴性。見圖3。

圖3 PGSF對IL-6mRNA 表達的影響

2.4PGSF對SOCS3基因表達的影響 與正常對照組相比，模型組BV-2細胞的SOCS3基因出現高表達(P<0.01)；PGSF-M組和PGSF-H組SOCS3表達明顯低于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。說明PGSF能夠降低OGD損傷后的SOCS3高表達，且高劑量最佳。見圖4。

圖4 PGSF對SOCS3mRNA表達的影響

3 討論

腦缺血再灌注損傷的發生機制復雜，興奮性毒性、氧化應激、細胞凋亡等都會參與，其中，缺血后炎癥反應在缺血性疾病的發生和發展進程中扮演著重要的角色。腦組織中主要的免疫應答細胞—小膠質細胞激活介導的炎癥反應是導致腦I/R損傷的重要機制。神經損傷后產生的細胞碎片、自由基、活性氧等均可激活小膠質細胞，激活后的小膠質細胞迅速釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子[5]，放大炎癥級聯反應，促炎因子又可激活小膠質細胞，形成惡性循環[6]。本研究采用BV-2細胞制備OGD/R模型，是腦I/R損傷常用的體外缺血模型，能夠很好地模擬神經元及神經膠質細胞的I/R損傷。結果發現缺氧處理后BV-2細胞明顯被激活，細胞呈球狀“阿米巴樣”，給予PGSF可明顯減輕形態學的改變；采用QPCR的方法檢測各組細胞的炎性因子基因表達情況，發現BV-2細胞在OGD/R后表達了大量炎性因子，而PGSF可降低OGD/R處理后的炎性因子基因表達。說明PGSF能夠抑制小膠質細胞激活，減少小膠質細胞釋放炎性因子。

SOCS3作為細胞因子信號的負調控因子，可被多種細胞因子誘導生成，同時又可對相應的信號轉導途徑進行負性調節，應用這種方式維持內環境的穩態[7]。在經典炎癥相關的JAK2/STAT3信號通路中，SOCS3本身是STAT3調節基因轉錄的產物之一，但又能負反饋抑制JAK2/STAT3信號的級聯反應[8]。本研究預期給予PGSF干預可通過促進SOCS3表達抑制炎癥相關信號通路進而發揮抗炎作用，但是與預期相反的是，SOCS3的表達不但沒有上調反而出現了下降。為了解釋這個現象我們需要對影響SOCS3表達的諸多因素進行綜合分析。SOCS3可受多種信號通路的調節。比如漢黃芩素可以通過PI3K介導的MAPK信號通路激活、AP-1共有序列和STAT響應元件的激活誘導SOCS3生成，Toll樣受體激活也誘導SOCS3表達。已有研究表明[9]，在LPS誘導的BV-2細胞神經炎癥模型中，PGSF是通過調節TLR4-PI3K/AKT—NF-κB信號通路減少神經炎性細胞因子的分泌，PGSF可以抑制炎癥模型中TLR4表達、下調MAPK信號通路的p38磷酸化水平并抑制NF-κB核移位[10]，而這些分子功能的抑制又可能導致SOCS3表達水平的降低。提示在PGSF的抗炎作用中，有多種信號轉導途徑參與，這些信號通路之間又存在復雜的交互作用。

本研究在細胞分子水平觀察了PGSF在腦I/R損傷中的抗炎癥作用，并發現PGSF能夠降低SOCS3mRNA的表達，提示SOCS3相關信號通路可能介導了PGSF的抗炎作用，為PGSF防治缺血性腦病的研發工作提供了新的實驗依據。