60Co γ射線對大鼠性激素水平以及PI3K/Akt信號通路蛋白表達的影響

趙粉琴，茍雅姣，胡芝霞，劉小莉，李春瑤，謝知慧，李淑萍

(1.甘肅中醫藥大學中西醫結合學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫院放療科，甘肅 蘭州 730000)

卵巢是女性重要的內分泌器官，具有內分泌和生殖功能.隨著腫瘤的年輕化，化療和放療是治療惡性腫瘤及自身免疫性疾病的重要手段，其對卵巢產生的不可避免的損傷已經成為誘發卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)的主要原因之一[1-2]，嚴重影響女性生殖內分泌功能.明確放療引起POF的分子機制對預防POF尤為重要.卵泡是維持卵巢功能的物質基礎，卵巢的儲備功能由卵巢內原始卵泡數決定，原始卵泡池的大小反應了卵巢壽命的長短，過度耗竭將導致POF，PI3K/Akt信號通路的平衡對于原始卵泡池的維持、生長和存活至關重要[3].目前，關于放療引起POF的分子機制尚不明確，有研究表明，放療輻射會激活PI3K/Akt通路[4-5]，放療導致卵巢早衰的機制是如何進行調控的，目前研究較少.本研究用60Co γ射線對大鼠進行照射，通過大鼠卵巢組織病理學，分析血清激素水平以及卵巢內PI3K/Akt信號通路蛋白表達情況，探討輻射對卵巢組織損傷的分子機制，為證明輻射損傷導致POF提供理論依據.

1 試驗方法

1.1 試驗動物及試劑

1.1.1 試驗動物以及模型制備 雌性SPF級SD大鼠6月齡40只(200±20)g，由甘肅中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK(甘)2004～0006.在自然光照條件下飼養，自由攝食、飲水，保持室溫20～25 ℃，3 d后用于試驗研究.每組大鼠各20只.隨機分為照射組：照射條件：60Co γ射線全身一次性照射6.0 Gy，劑量率1.143～1.21 Gy/min；(照射地點在蘭州大學第一醫院放療科,高能直線加速器，型號：ONCOR Impression Plut)，照射源皮距為100 cm，在10 cm×10 cm特制鉛模中，照射野大小為2.0cm×2.0cm照射范圍.；正常組：不進行照射，普通喂養.照射后大鼠進行無菌飼養(房間用1∶5 000濃度的高錳酸鉀噴灑消毒，空氣用紫外線燈照射30 min，2次/日，飼料、水及墊料均經高壓滅菌).

1.1.2 主要試劑 Akt(廠家：SantaCruz，貨號：sc-81434，規格：50 μg)、磷酸化Akt(廠家：SantaCruz，貨號：sc-514032，規格：200 μg)、Foxo3a(廠家：Abcam，貨號：ab70314，規格：100 μL，)、磷酸化Foxo3a(廠家：Abcam，貨號：ab47285，規格：100 μg)蛋白單克隆抗體.蛋白電泳儀(廠家：Bio-rad，型號：164-5050).

1.2 觀察指標及檢測方法

1.2.1 大鼠動情周期觀察以及陰道脫落細胞檢測 每天早上9:00進行陰道脫落細胞涂片觀察.以生理鹽水潤濕棉簽，取陰道脫落細胞涂于載玻片，自然干燥，甲醇固定1 min，室溫自然干燥，快速瑞姬氏染液染色，PBS沖洗3次，于光學顯微鏡下觀察.根據陰道涂片表現，正常大鼠動情周期4～5 d，包括動情前期、動情期、動情后期以及動情間期；雌性大鼠動情周期的判斷[6]：鏡下見大量有核上皮細胞和少量白細胞為動情前期；鏡下見大量角質化、大而無規則的無核上皮細胞為動情期；有核上皮細胞、角化上皮細胞和白細胞均存在為動情后期；大量白細胞和少量角質化細胞為動情間期.若動情周期延長至7 d以上，或者無明顯的周期表現，持續處于動情間期，則動情周期紊亂.

1.2.2 大鼠血清性激素水平的檢測 分別于照射前，照射后第1、3、7、14、21天斷尾采血，將所采血液接入1.5 mL離心管中，在4 ℃以3 000 r/min離心10 min，取出離心管，使用移液槍吸取上層血清移入新的離心管中，標記存放在-20 ℃冰箱內備用.采用ELISA法檢測血清卵泡刺激素(FSH)、雌激素(E2)和黃體生成素(LH)，按試劑盒操作步驟進行，96孔檢測，設置空白孔(不加樣)，標準孔(加樣50 μL)，待測孔(先加樣品稀釋液40 μL，再加待測樣10 μL)，封閉，37 ℃，溫育30 min，后洗滌，甩干，后各孔加酶標試劑50 μL(空白孔除外)，37 ℃，溫育30 min，洗滌，每孔加顯色劑A 50 μL，每孔加顯色劑B 50 μL輕震蕩，顯色10 min，每孔再加終止液50 μL，在15 min內使用酶標儀在450 nm波長進行吸光度(D)檢測，按照標準品及D值繪制標準曲線，獲得直線回歸方程式，計算出樣品中激素的實際濃度.

1.2.3 TUNEL法觀察卵巢組織顆粒細胞凋亡 分別于照射前，照射后第3、7、14、21天，取大鼠4只脫頸椎處死，解剖取出大鼠卵巢組織，各約0.5 cm2大小，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，將組織切片備用.參照凋亡檢測試劑盒說明書要求進行TUNEL檢測：白片脫臘、水化，20 μg/mL蛋白酶K37 ℃孵育15 min，過氧化氫浸泡5 min，每個標本滴加約10 mL的TUNEL反應液，暗室中37 ℃孵育60 min后,PBS沖洗，滴加約50 μL TdT+450 μL熒光素標記的dUTP液混勻，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中37 ℃反應60 min.PBS漂洗3次，玻片干燥后在熒光顯微鏡下計數凋亡細胞(激發光波長為450～500 nm，檢測波長為515～565 nm)，2組分別取6個卵巢，每個卵巢隨機選取一張切片，每張切片隨機選取5個視野(600×)，試驗重復3次.計數兩組卵巢切片上卵母細胞凋亡.

1.2.4 卵巢組織切片觀察 分別選取照射前，照射后第3、7、14、21天卵巢組織，一部分卵巢組織在4%多聚甲醛PBS中固定過夜(pH 7.6) (PBS,Sigma)，轉至70%乙醇中處理.固定組織經常規石蠟包埋脫水步驟.卵巢組織切片4 μm，依次在90%、70%、30%的酒精和蒸餾水中進行脫蠟和再水化，另一部分PBS洗滌5 min，蘇木精和伊紅染色(BDH，普爾，英國)顯微鏡下觀察卵巢組織卵泡變化情況(卵泡數目和發育階段).

1.2.5 免疫組織化對大鼠卵巢組織蛋白表達的分析 取大鼠卵巢組織各約0.5 cm2大小，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，組織切片.石蠟切片經二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，下行至蒸餾水.PBS洗3次，每次5 min.3 %過氧化氫室溫避光作用20 min.蒸餾水洗.正常山羊血清封閉液室溫作用30 min.倒掉封閉液后，滴加一抗工作液(1∶200)，4 ℃孵育過夜.PBS洗3次，每次5 min.滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或小鼠二抗工作液，室溫作用30 min.PBS洗3次，每次5 min.滴加DAB顯色液，室溫避光作用10 min，顯微鏡下控制顯色時間.蒸餾水洗，蘇木素染液作用5 min.蒸餾水洗，1%鹽酸酒精分色10 s，經0.1 mol/L pH 7.4 PBS作用15 min.經梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封片，鏡下觀察.同時設染色對照，PBS替代一抗于4 ℃孵育過夜.觀察蛋白表達部位.購買一抗，利用辣根過氧化物酶標記二抗和DAB進行染色.陽性結果以棕黃色或黃色顯示.染色后，以顯微照相系統觀察、拍照.每個卵巢隨機選取一張切片，每張切片隨機選取5個視野(600×)，試驗重復3次.將結果輸入Image-Pro-Plus圖像分析軟件，測量卵巢內Akt、磷酸化Akt、Foxo3a、磷酸化Foxo3a蛋白表達陽性部位的平均光密度(optical density,D)值.

1.3 統計方法

2 結果與分析

2.1 大鼠動情周期觀察以及陰道脫落細胞檢測

2.1.1 大鼠動情周期觀察 輻射組大鼠動情周期延長，與正常組比較差異顯著(P<0.01).同時大鼠出現毛發脫落，躁動不安，體質量降低等現象(表1).

2.1.2 大鼠陰道脫落細胞檢測 正常大鼠陰道細胞涂片觀察結果：可見大量角化細胞，形狀大而不規則，細胞著色較深；輻射照射后大鼠動情期紊亂，細胞無周期性改變；照射第7天陰道脫落細胞觀察結果：角化細胞略減少,細胞染色稍淡；照射第14天陰道上皮細胞體積明顯縮小，較幼稚，角化細胞明顯減少，漸消失，并逐漸被白細胞所代替；照射后21天，陰道角化細胞明顯減少,可見小而圓形，核大的底層細胞，細胞著色較淺(圖1～圖4).

表1 大鼠動情周期觀察

可見大量角化上皮細胞，形狀大而不規則，尚有少量上皮細胞.There are numerous keratinized epithelial cells,which are large and irregular in shape and have no nucleus.圖1 空白組 HE×100(動情期)Figure 1 Control(estrous phase) HE×100

2.2 大鼠血清性激素水平測定

進行單因素方差分析，認為輻射照射后，大鼠血清FSH、LH水平隨著輻射對卵巢功能的損傷而逐漸降低，輻射第21天降到最低，與其他各組(除輻射第14天外)比較，有顯著差異(P<0.01)；E2水平逐漸降低第7天達到最低(P<0.01)，之后有所回升(表2).

2.3 TUNEL法檢測卵巢內顆粒細胞凋亡情況

各組之間凋亡細胞數比較，在20倍視野下，10個卵巢組織切片上顆粒細胞凋亡數比較，輻射損傷造成卵巢顆粒細胞明顯凋亡(P<0.01)；而且隨著輻射時間的延長顆粒細胞凋亡數量逐漸增加，在輻射損傷第21天達到高峰(P<0.01)，結果見表3.

可見角化細胞亦減少,細胞著色較淺.Note the presence of nucleated cells,a few keratinocytes and leukocytes.圖2 照射第7 d HE×100(動情期)Figure 2 Irradiated 7 d(pre-estrus) HE ×100

上皮細胞體積小，幼稚，角化細胞少，漸消失，可見白細胞.Large number of leukocytes and a few nucleated cells.圖3 照射第14 d HE×100(動情期)Figure 3 Irradiated 14 d(estrous interphase) HE×100

可見角化細胞明顯減少,細胞染色稍淡.Lots of white blood cells,slightly more nucleated cells.圖4 照射21 d HE×100(動情期)Figure 4 Irradiated 21 d(estrous interphase) HE×100

表2 大鼠血清FSH,LH 和E2結果分析

表3 計數輻射損傷不同時間段組卵巢切片上凋亡顆粒細胞數

2.4 大鼠卵巢組織病理學分析

對照組大鼠卵巢正常，形態學觀察可見正常發育的卵泡，顆粒細胞層排列整齊(圖5).輻射組可見卵泡閉鎖.閉鎖卵泡的顆粒層松散，大部分的卵泡為無卵細胞(圖6).

2.5 免疫組化法測量和標記大鼠卵巢內Akt、磷酸化Akt、Foxo3a、磷酸化Foxo3a蛋白表達

2.5.1 免疫組化法測量大鼠卵巢內Akt、磷酸化Akt、Foxo3a、磷酸化Foxo3a蛋白表達陽性部位的平均光密度值 利用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件，測定棕黃色信號的累積光密度值(IOD)，結果以累積光密度值的數字表示.輻射照射后，大鼠卵巢組織明顯受損，檢測不同時間段卵巢組織內Akt、磷酸化Akt、Foxo3a、磷酸化Foxo3a蛋白表達，結果顯示隨著照射時間延長總Akt、p-Akt、Foxo3a 蛋白的表達呈現逐漸增加的趨勢(P<0.01)，尤以總Akt和Foxo3a蛋白的表達最顯著(P<0.01)；而p-Foxo3a蛋白表達逐漸下降(P<0.01)，尤以輻射第21天最顯著(P<0.01).結果見表4，圖7.

圖5 正常大鼠卵巢組織Figure 5 Ovarian tissue of control

圖6 輻射組大鼠卵巢組織Figure 6 Ovarian tissue of radiation

表4 輻射損傷大鼠卵巢組織Akt/Foxo3a通道蛋白表達陽性部位的平均光密度(D)值分析

圖7 輻射損傷大鼠卵巢組織PI3K/AKT通道蛋白表達Figure 7 Expression of Akt/ Foxo3a channel protein in the ovarian tissue of rats with radiation injury

2.5.2 免疫組化法標記大鼠卵巢內Akt、磷酸化Akt、Foxo3a、磷酸化Foxo3a蛋白表達陽性部位 陽性信號標記為棕黃色，主要見于卵母細胞、黃體細胞(圖8～12).

3 討論

卵巢是對輻射極為敏感的器官，而性腺中卵巢內的卵細胞又是輻射最敏感的細胞.既往有研究表明[7]，極低劑量的放射線就能夠促進發育過程中的生長卵泡及成熟卵泡走向凋亡，并導致不育.Meirow等[8]研究報道雌性青年大鼠暴露于0.1 Gy的電離輻射兩周，原始卵泡幾乎完全被破壞.但是輻射損傷的分子機制目前還不明確[9].試驗顯示對照組大鼠卵巢正常，形態學表現可見正常發育的卵泡，顆粒細胞層排列整齊.輻射組可見卵泡閉鎖，閉鎖卵泡的顆粒層松散，大部分的卵泡為無卵細胞.陰道脫落細胞檢測發現大鼠動情周期消失，出現內分泌紊亂.同時血清學檢測卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)水平下降明顯(P<0.01)，FSH和LH水平明顯下降可能與高劑量輻射影響垂體分泌功能，導致兩種促性腺激素(FSH和LH)表達量下調有關.此研究與Mahran Y F等[7]研究類似.同時雌二醇(E2)開始下降，到輻射第7天最低，之后逐漸上升，卵巢顆粒細胞凋亡顯示細胞凋亡明顯(P<0.01).雌二醇由卵巢顆粒細胞合成分泌，在卵泡內儲存，隨著卵母細胞成熟，其量逐漸增加，早期輻射損傷顆粒細胞，雌二醇下降，之后雌二醇水平上升，說明卵母細胞最后受損，細胞崩解，卵泡膜破碎，卵泡內雌二醇釋放入血.對此現象我們認為其符合顆粒細胞保護學說，因為雌激素是由卵泡膜表面卵泡膜細胞和顆粒細胞在FSH和LH共同作用下合成的[10]，李桂芝等[11]研究表明FSH對于原始卵泡的恢復發育有關鍵作用，極低的FSH不能促進卵泡發育.顆粒細胞對卵母細胞主要起支持、營養和保護作用，當顆粒細胞損傷和破壞后卵母細胞能量和營養供應中斷，影響到卵母細胞的活力，最終閉鎖退化.PI3K/Akt 通路是廣泛存在于細胞內重要的生存信號轉導通路之一，其激活與細胞增殖、分化、凋亡、自噬密切相關[12-15].研究表明[16-17]PI3K/Akt與原始卵泡發育有關，PI3K介導的Akt 激活，Foxo3a過度磷酸化，運出細胞核，刺激原始卵泡啟動[18]，過早過多啟動原始卵泡，大量耗竭，導致卵巢早衰的發生.楊靜等[19]通過觀察研究，驗證了 PI3K/Akt 信號通路參與卵巢功能衰退(POF)的發生.Jang等[20]、Roness等[21]和Yi等[22]研究順鉑等化療藥物也是通過上調PI3K/Akt通路引起卵泡池耗竭加速導致POF.放射引發POF是否與PI3K/Akt信號通路有關，目前未見相關報道.本試驗顯示：Akt、磷酸化p-Akt和Foxo3a蛋白表達明顯增加(P<0.01)，刺激原始卵泡過度活化消耗，導致POF發生.聶明月等[23]研究表明Foxo3a主要在原始卵泡及早期初級卵泡卵母細胞核表達，在以后階段的卵泡中表達減少，所以隨著卵巢原始卵泡數量減少，而磷酸化Foxo3a表達明顯減少，本試驗研究也證實了這一點(P<0.01).推測輻射對卵母細胞損傷可能源于PI3K/Akt 信號通路激活誘發顆粒細胞凋亡，導致卵母細胞營養供應中斷有關合成.卵母細胞損傷卵泡的耗竭[24]，內分泌功能受到嚴重影響[25-26]，造成POF[27-28]，Agorastos等[29]研究表明照射劑量、時間長短與卵巢功能能否保留密切相關.

★表示蛋白陽性部位，比例尺50 μm.★ indicates the positive part of protein,the scale bar is 50 μm.圖8 正常卵巢卵母細胞Figure 8 Normal ovary oocytes

★表示蛋白陽性部位，比例尺50 μm.★ indicates the positive part of protein，the scale bar is 50 μm.圖9 輻射卵巢卵母細胞Akt蛋白表達處Figure 9 Expression of Akt protein in irradiated ovary oocytes

★表示蛋白陽性部位，比例尺50 μm.★ indicates the positive part of protein，the scale bar is 50 μm.圖10 輻射卵巢卵母細胞p-Akt蛋白表達處Figure 10 Expression of p-Akt protein in irradiated ovary oocytes

★表示蛋白陽性部位，比例尺50 μm.★ indicates the positive part of protein，the scale bar is 50 μm.圖11 輻射卵巢卵母細胞p-Foxo3a蛋白表達處Figure 11 Expression of p-Foxo3a protein in irradiated ovary oocytes

★表示蛋白陽性部位，比例尺50 μm.★ indicates the positive part of protein，the scale bar is 50 μm.圖12 輻射卵巢卵母細胞Foxo3a蛋白表達處Figure 12 Expression of Foxo3a protein in irradiated ovary oocytes

因此，研究表明放療導致POF分子機制可能包括，一方面上調卵巢內PI3K/Akt/Foxo3a信號通路誘導顆粒細胞凋亡使卵母細胞營養和能量供應中斷，導致卵泡凋亡閉鎖；另一方面放射治療影響垂體內分泌功能，下調FSH和LH，減弱對卵泡發育的刺激，導致POF的發生.所以對于放療損傷引起的POF是一種不可逆的損傷，尤其是對卵母細胞的發育.放療治療前的卵子冷凍以及卵巢組織移位保護是一種可取的維持生殖功能的方法.