循環腫瘤細胞上皮-間質轉化對腫瘤發生發展的影響及其臨床應用潛力

王 樂(綜述)， 張志強， 陳建松， 陳 卓(審校)

循環腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTCs) 是指脫離原發腫瘤或轉移部位并存在于外周血中循環的各類腫瘤細胞，是腫瘤發生遠處轉移導致治療失敗的根源[1]。CTCs代表原發腫瘤的表型和遺傳組成，其類型和數量變化與腫瘤動態密切相關，是轉移性癌癥如乳腺癌、前列腺癌等的預測指標[2-3]。2007年，美國臨床腫瘤協會(American society of clinical oncology, ASCO)將CTCs納入腫瘤標志物。

雖然CTCs很早就被發現[4]，但直至上世紀末尤其是本世紀初，隨著分子生物學、計算機技術的發展，以及免疫標記技術、分子生物學技術的突飛猛進，CTCs的分離檢測技術才得到迅速發展。大量研究表明，CTCs以不同形態存在于外周血中，既有游離的單個CTC，也有聚集成團的細胞團。近年來，研究人員發現腫瘤細胞在進入外周血循環的過程中會發生上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[5]，即上皮細胞來源的實體腫瘤或轉移灶的腫瘤細胞在特定條件下通過特定程序失去細胞極性，失去與基底膜連接等上皮表型，并轉化為具有間質表型細胞的生物學過程。因此，CTCs存在不同類型，包括上皮細胞表型、間質細胞表型和上皮細胞與間質細胞混合表型，既表現表皮細胞特性，又表現間質細胞特性，呈現出原發灶腫瘤細胞和轉移灶腫瘤細胞的混合細胞狀態[6]。值得注意的是，通過EMT，實體瘤上皮細胞發生變化，增加了流動性和侵襲性，易脫離組織進入血液，最后發展為遠端轉移。隨著癌癥患者對治療藥物耐藥性的產生，其血液中的CTCs越來越多表現出間質細胞特性[6]。由此可見，CTCs的EMT(CTCs-EMT)程度不僅可監測腫瘤動態、評估治療效果，也可用于復發風險評估，有助于實現實時個體治療。

1 CTCs-EMT與腫瘤增殖

在過去的幾十年中，腫瘤患者外周血中CTCs的檢測已經獲得越來越多的關注。源自原發性腫瘤灶的具有高度侵襲性的腫瘤細胞不斷增殖，它們離開原發腫瘤灶、進入外周血后就成為具有侵襲和轉移潛能的CTCs。已有研究證實[7]，CTCs-EMT是一種細胞形態轉化過程，與腫瘤的增殖密切相關，主要表現為：(1)形態改變：細胞由鵝卵石樣變為紡錘體樣，細胞極性喪失，骨架改變，浸潤與遷移能力增強。(2)分子標志物改變：上皮化分子標志物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)等表達水平下降，間質化分子標志物波形蛋白(vimentin)等表達水平上升。許多研究已經建立了EMT和各型CTCs形成之間的聯系，如在對乳腺癌患者血液CTCs的水平監測中，發現疾病進展的乳腺癌患者，形成細胞團簇的CTCs主要為間質表型，其分泌轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)，協同血液循環中FOXC1轉錄因子促進CTCs-EMT[8]。EMT現象也存在于原發性肝癌患者外周血CTCs中，肝癌患者外周血樣CTCs-EMT的含量與其預后密切相關[9-10]。因此，外周血CTCs-EMT檢測有望成為診斷原發性肝癌的新型生物標記物。此外，經過根治性切除原發性腫瘤并接受化學藥物治療或放射治療的癌癥患者，其體內依然存在微小瘤灶或微量腫瘤細胞[11-12]，這些腫瘤細胞在一定時間范圍內可進入休眠，但仍具增殖潛能，可在數年乃至數十年后再次增殖，導致腫瘤復發。

2 CTCs-EMT與腫瘤轉移

大約90%腫瘤患者的死亡是因腫瘤轉移造成的。因此，腫瘤轉移被認為是導致腫瘤患者死亡的最主要原因。腫瘤轉移的過程主要包括：原發瘤對鄰近組織的侵襲、CTCs產生、CTCs遷徙入血、CTCs在循環中生存、CTCs在遠隔部位滲出血管并定植形成轉移灶、轉移灶的二次轉移。CTCs在循環系統中一般只能維持數秒至數分鐘。大部分CTCs進入血循環后隨即凋亡，但有些CTCs(不足0.01%)通過循環系統到達遠處組織，形成新的腫瘤。相對于單個CTC，CTCs聚集成團的形式可使其抵御其他細胞(如自然殺傷細胞)攻擊的能力增強，不僅能有效抵抗凋亡，而且有助于其駐留在微血管腔內(微血管腔的直徑達8 μm就能捕獲CTCs)。CTCs聚集成團，由于細胞之間通過黏附的形式首尾相連，形成單細胞鏈的方式通過微血管腔，有助于其遠處轉移。

早在2013年，Yu等[13]通過對乳腺癌患者的CTC動態監測和CTC的轉錄組分析，發現乳腺癌患者的CTCs通過EMT途徑增加轉移和侵略性，并表示間質型CTC與疾病進展有關。之后越來越多的臨床研究發現：晚期癌癥患者的CTCs更傾向于表達波形蛋白、纖連蛋白、N-鈣黏蛋白和O-鈣粘蛋白等CTCs-EMT相關蛋白[14-15]。如結直腸癌患者的CTCs中，上皮間質混合型及間質型的占比程度與患者的臨床分期、淋巴結及遠處轉移等密切相關[16]；晚期原發性肝癌患者的CTCs中，間質型CTCs的占比高，而上皮型或上皮-間質混合型CTCs的占比與早期肝癌患者并無顯著差異[17]；惡性上皮性卵巢癌患者的CTCs-EMT具有促進腫瘤細胞轉移能力，增加其侵襲性[18]。這些腫瘤細胞發生CTCs-EMT過程涉及到許多分子水平和細胞水平的變化，如上皮細胞蛋白(如E-鈣黏蛋白，閉合蛋白和細胞角蛋白)水平下調、間質細胞蛋白(如N-鈣黏蛋白，纖連蛋白和波形蛋白)水平上調等。其中，E-鈣黏蛋白是CTCs-EMT或其逆過程——間質-上皮轉化(mesenchymal-epithelial, MET)發生的重要調控者。這些蛋白表達水平的改變可促進腫瘤細胞絲狀偽足形成，從而增強腫瘤細胞的侵襲轉移以及在不利環境中的生存能力[19-20]。

3 CTCs-EMT與腫瘤耐藥

化學藥物治療是目前治療惡性腫瘤的重要手段之一。然而，腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥最終導致化療失敗。通過對130例患者化療前后的血樣分析發現，化學療法導致癌癥干細胞和具有EMT特征的CTCs的數量顯著增加，直接影響了總體生存期[21]。其中，具有EMT特征的CTCs具有化療耐受性，可獨立預示轉移性乳腺癌的預后不良。此外，在Ⅰ期及Ⅲ期原發性乳腺癌患者中，接受新輔助治療(即在術前進行化療，達到縮小腫瘤的目的)患者的CTCs-EMT誘導的多種轉錄調控因子，包括Twist相關蛋白1(TWIST1)、SNAIL1、SLUG、ZEB1和FOXC2的表達均顯著提高[22]。這些轉錄調控因子在多種惡性腫瘤中高表達，其中有些轉錄因子之間可以相互作用，直接激活下游轉錄因子的啟動序列，共同促進CTCs-EMT轉變，從而導致腫瘤細胞轉移、腫瘤耐藥產生等。因此，抑制CTCs-EMT有助于提高腫瘤患者對化療藥物的敏感性，延長患者的生存期。

4 CTCs-EMT檢測及其臨床應用

采集于液體活檢樣本的CTCs實時監測，是監控治療效果和調整治療方案的重要依據，有助于針對腫瘤患者制定精準治療方案，用于指導腫瘤靶向治療。由于CTCs在外周血中的含量極為稀少(一般認為，外周血中105～107個單核細胞中才有1個CTC)，因此，對CTCs檢測的靈敏度和特異性提出了極高的要求。目前針對CTCs的分離檢測技術主要分為：根據細胞表面標志物的免疫捕獲法進行陽性富集法(如CellSearchTM系統、CTC-chip及MACS?Cell Separation磁性細胞分選系統)和陰性篩選法(如Easy Sep和Cyttel/Cytelligen檢測系統)；根據細胞大小的濾膜過濾法分離上皮源腫瘤細胞(ISET)以及根據細胞密度的密度梯度離心法[23](如OncoQuick分離體系，表1)。其中，美國食品藥品監督管理局(food and drug administration, FDA)批準了用于多種癌癥(如轉移性乳腺癌、前列腺癌、結腸癌等)CTCs臨床檢測的CellSearchTM自動化系統，就是基于上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)在上皮細胞和上皮腫瘤細胞中表達水平的差異[24]，利用EpCAM抗體對CTCs進行捕獲富集后檢測的產品。Guo等[25]借助稀土納米粒子的溶解增強熒光放大技術和長壽命的稀土離子配合物熒光信號，發展了一種靶向上皮腫瘤細胞表面高表達的EpCAM，并有效克服血液樣品中復雜短壽命背景熒光信號的干擾，實現對全血CTCs的直接檢測。

表1 目前常見的CTCs檢測技術比較Tab.1 Comparison of common CTCs detection technologies

與CTCs比較，CTCs-EMT不僅在細胞形態和移動性上均有所改變，其細胞基因表達譜往往會出現上皮細胞標志物[如EpCAM和細胞角蛋白(cytokeratin，CK)]的下調及間質細胞標志物[如細胞表面波形蛋白(cell surface vimentin, CSV)]和轉錄因子twist1]的上調[26]，即僅通過EpCAM抗體富集CTCs的檢測手段無法檢測CTCs-EMT，從而導致假陰性。

由于CTCs-EMT具有高表達N-鈣黏蛋白的特性，具有選擇性及競爭性結合N-鈣黏蛋白并阻斷其活性的環五肽化合物exherin(ADH-1)備受關注。借助納米粒與環五肽化合物ADH-1偶聯，可顯著下調N-鈣黏蛋白水平，并對腫瘤細胞的侵襲和轉移具有抑制作用[27]。利用環五肽化合物ADH-1構建該多肽修飾的脂質體具有抑制N-鈣黏蛋白活性，可有效遏制腫瘤細胞遷移，并恢復耐藥腫瘤細胞對化療藥物敏感性的作用[28]。這些研究結果提示：CTCs-EMT與腫瘤的轉移及復發具有密切聯系，有望成為腫瘤CTCs檢測的新的補充靶點。

在對臨床癌癥患者外周血的分析中發現：發生遠處轉移的結腸直腸癌患者，其外周血CTCs-EMT高表達具有重要預后評估價值的標志物Plastin 3(PLS3)[29]；在前列腺癌患者的外周血樣中，其CTCs-EMT細胞表面高表達間質細胞標志物CSV[30]。借助上皮細胞和間質細胞的標志物(EpCAM，CK8/18/19，CSV和Twist1)可對來自肝癌、鼻咽癌、胃癌、乳腺癌、結腸癌及非小細胞肺癌患者的CTCs進行表征，并可區分上皮CTCs、生物表型上皮/間質CTCs和間質CTCs[31]。Po等[32]也證實：聯合間質細胞標志物N-鈣黏蛋白和上皮細胞標志物EpCAM富集晚期卵巢癌患者血液中的CTCs，比單獨使用EpCAM的富集效率明顯提高，而且利用細胞表達的N-鈣黏蛋白可成功捕獲CTCs-EMT。Zeinali等[33]通過一種慣性微流迷宮裝置(inertial microfluidic Labyrinth device)對轉移性非小細胞肺癌患者的CTC/CTC簇進行高通量分析。基于細胞大小檢測不同CTC群體，包括表達上皮(EpCAM)，間充質或兩種標記的CTCs；發現大部分患者的CTCs中75%是EpCAM陰性CTCs。因此，有理由認為，聯合間質細胞標志物和上皮細胞標志物的檢測手段能有效降低或減免假陰性結果(圖1)。

CTCs:循環腫瘤細胞; EMT:上皮-間質轉化。圖1 CTCs-EMT檢測示意圖Fig.1 Schematic diagram of CTCs-EMT detection

5 展 望

CTCs-EMT在腫瘤轉移、復發以及腫瘤耐藥性產生等方面均發揮重要作用，有關CTCs-EMT的基礎和臨床治療研究已成為腫瘤學領域的研究熱點之一。作為一個新的研究領域，無疑有大量未知問題亟待解決：如何篩選或鑒定出高特異性及高靈敏性的CTCs-EMT標志物及其在不同類型CTCs中的表達譜；如何研發適于臨床CTCs-EMT檢測技術；如何建立CTCs-EMT腫瘤轉移模型等。顯然，深入研究CTCs-EMT產生和轉化機制有助于理解腫瘤的發生、發展和轉移進程。同時，提高CTCs-EMT檢測的特異性、敏感性和準確性，將對癌癥患者的預后評估具有重大現實意義，同時也為制定個體化精準治療策略提供重要依據。