乳鐵蛋白對去卵巢大鼠骨組織中IGF-Ⅰ、IGFBP-3、IGFBP-5表達的影響

陳 壹， 巫曉強， 林慶明， 侯建明

骨質疏松是一種因骨吸收和骨形成解耦連，出現骨密度降低、骨微結構破壞的全身代謝性骨病。 絕經后婦女因雌激素水平下降，破骨細胞的活性明顯高于成骨細胞，逐漸出現骨質疏松。雌二醇或二磷酸鹽的替代療法可使因絕經導致骨質疏松患者的骨量增加，但這些藥物存在增加婦科惡性腫瘤概率等副作用。乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)是一種由上皮細胞及外分泌腺分泌、相對分子質量為80 kDa的鐵結合糖蛋白，不僅具有潛在的免疫調節功能，還能通過抑制破骨細胞形成，促進成骨細胞增殖、分化而增加骨量[1]。但LF通過何種分子機制促進骨形成值得探究。胰島素樣生長因子Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)是一種能夠促進骨組織代謝及生長的細胞因子[2]，同時，IGFBPs (insulin-like growth factor binding proteins)可以通過阻止或易化IGF-Ⅰ與目標細胞表面IGF-Ⅰ受體(insulin-like growth factor-I receptor，IGF-ⅠR)的結合而影響骨形成[3]。體外研究表明，LF不僅促進IGF-Ⅰ/IGF-ⅠR mRNA的表達[4]，還可通過促IGF-Ⅰ mRNA的表達阻止原代成骨細胞凋亡[5]。本研究擬探討口服LF 6個月后對去卵巢大鼠骨量及骨組織中IGF-Ⅰ、IGFBP-3、IGFBP-5 mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 70只6個月齡健康雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠，體質量(250±20) g [福建醫科大學實驗動物中心，動物批號：SCXK(閩)2012-0001]。

1.1.2主要試劑 97% LF(批號：BN002865，產于新西蘭，南京天淳公司)；牛血清白蛋白(美國Sigma公司)；苯甲酸雌二醇(杭州動物制藥廠)；TRIzol RNA 提取試劑盒(美國 Invitrogen 公司)；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(日本 TaKaRa 公司)；DEPC水(美國 Biosharp 公司)。

1.2方法

1.2.1建模和分組 SD大鼠在室溫(20±3)℃、相對濕度為40%～60%的環境中分籠飼養，自由飲水，喂以經高壓處理的普通飼料。適應性喂養 1 周后，隨機分為 7 組：假手術組和去卵巢模型及其干預組 6 組，每亞組 10 只。所有大鼠均予腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g，假手術組僅切除卵巢附近與之等質量的脂肪組織；干預組作背部脊柱兩側切口，摘除雙側卵巢。術后1周依不同干預措施分組:

1.2.1.1骨質疏松模型組(Con組) 2 mL蒸餾水每天灌胃1次。

1.2.1.2假手術組(Sham組) 2 mL蒸餾水每天灌胃1次。

1.2.1.3骨質疏松模型雌激素干預組(E2組) 苯甲酸雌二醇0.1 mg/kg每周肌內注射1次。

1.2.1.4骨質疏松模型牛血清白蛋白組(bovine serum albumin，BSA組) 將100 mg/kg的BSA溶解于2 mL蒸餾水，每天灌胃1次。

1.2.1.5不同劑量的骨質疏松模型LF1～LF3組 分別將100，1 000，2 000 mg/kg的LF溶解于2 mL蒸餾水，每天灌胃1次。

每周稱體質量1次，根據體質量變化調整藥品用量，每千克體質量藥量濃度不變。持續稱量6個月。

1.2.2標本采集與脫鈣 干預 6個月后處死動物，分離大鼠的股骨和脛骨。收集各組大鼠的右側股骨，-80 ℃冷凍。將左側脛骨置于4%多聚甲醛中，24 h 后放入10%EDTA脫鈣液中，根據脫鈣程度置換脫鈣液直至脫鈣終點。切取干骺端的骨組織。

1.2.3蘇木精-伊紅(H-E)染色及圖像分析 將脫鈣后的骨組織用不同濃度的乙醇脫水，再用二甲苯作透明處理，石蠟包埋。將蠟塊固定在切片機上，截取距脛骨骺線約 0.2 mm位置干骺端的薄片，厚度 5～8 μm。切片脫蠟、水合，經H-E染色后，光學顯微鏡下拍攝截面圖。采用Image-Pro Plus 6.0軟件計算骨小梁平均面積所占骨髓腔比例(比值)。

1.2.4實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time PCR，RT-PCR) 采用TRIzol試劑分離股骨近端骨組織總RNA。檢測該樣品在波長260和280 nm處的OD值(ND-1000紫外分光光度計，OD比1.8～2.0)，計算骨組織RNA的濃度。再用逆轉錄試劑盒將 5 mg 總RNA逆轉錄成cDNA。實時熒光定量PCR反應(96孔板，反應體系25 μL)，其中包括SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、cDNA及目標基因引物(引物序列見表1)。在Thermal Cycler DiceTMReal Time系統中行RT-PCR檢測。所有反應重復3次，β-actin作為內參，設定正常對照組目的基因mRNA相對表達量為1，應用2-△△Ct法計算：

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 The primer sequences for quantitative real-time PCR

(1)△Ct對照樣品=目的基因(meanCt)-管家基因(meanCt)

△Ct待測樣品=目的基因(meanCt)-管家基因(meanCt)

(2)對照樣品及待測樣品的歸一列式：

△△Ct=△Ct待測樣品—△Ct對照樣品均值

(3)mRNA表達相對量=2-△△Ct

2 結 果

2.1體質量比較 干預前各組體質量比較，差別無統計學意義(均P>0.05，表2)。干預結束后，除Sham和E2組外，其他組的大鼠體質量均明顯增加，其中Con組較Sham組和E2組顯著增加(均P<0.01)。BSA和LF1～LF3組的體質量均低于Con組，差別無統計學意義(均P>0.05，表2)。在雌激素的作用下，E2組未出現因切除卵巢引起的體質量增加。

表2 干預 6個月前后各組體質量變化Tab.2 The body weights among the seven groups before and after 6 months of treatment

2.2骨組織H-E染色病理切片及圖像分析 E2和Sham組的骨小梁密度較其他各組致密；Con組和BSA組不如LF1～LF3組致密。同時，肉眼無法分辨LF1～LF3組間的骨小梁密度差別(圖1)。Image-Pro Plus 6.0分析數據表明，E2和Sham組的比值顯著高于Con、BSA及LF1～LF3組(均P<0.01，圖2)。與LF1～LF3組比較，Con和BSA組的比值明顯降低(均P<0.01，圖2)。Sham與E2組、Con與BSA組、LF1～LF3組各組間比值比較，差別均無統計學意義(P>0.05，圖2)。

LF:乳鐵蛋白。A：Con 模型組；B：Sham 假手術組；C：E2 雌激素組；D：牛血清白蛋白100 mg/(kg·d)組；E～G：LF 100， 1 000， 2 000 mg/(kg·d)組。圖1 脛骨干骺端病理組織切片(H-E染色 ×40)Fig.1 Hematoxylin and eosin-stained section of metaphysis under the tibia(H-E ×40)

表中數據為模型組；Sham：假手術組；E2：雌激素組；BSA：牛血清白蛋白100 mg/(kg·d)；LF1：乳鐵蛋白100 mg/(kg·d)；LF2：乳鐵蛋白1 000 mg/(kg·d)；LF3：乳鐵蛋白2 000 mg/(kg·d)；與Con組比較，●：P<0.01；與Sham組比較，△：P<0.01。圖2 干預6個月后各組骨小梁平均面積所占骨髓腔比例Fig.2 The area ratio of trabecular area by marrow cavity

2.3股骨IGF-Ⅰ、IGFBP-3和IGFBP-5 mRNA的表達情況 干預 6個月后，Sham、E2、LF1～LF3組中的IGF-Ⅰ mRNA水平較Con組明顯升高(均P<0.01，圖3A)。與E2和Sham組比較，Con組的IGFBP-3 mRNA表達水平顯著降低(P<0.01，圖3B)，而LF1～LF3組中IGFBP-3 mRNA水平均明顯低于Con組(均P<0.01，圖3B)。此外，E2和Sham組的IGFBP-5 mRNA水平顯著升高(均P<0.01，圖3C)。雖然不同LF組的IGFBP-5 mRNA水平均高于Con組，但僅LF2～LF3組的IGFBP-5 mRNA水平升高有統計學意義(P<0.05和P<0.01，圖3C)。

表中數據為胰島素樣生長因子;IGFBP：胰島素樣生長因子結合蛋白。Con：模型組；Sham：假手術組；E2：雌激素組；BSA：牛血清白蛋白100 mg/(kg·d)；LF1：乳鐵蛋白100 mg/(kg·d)；LF2：乳鐵蛋白1 000 mg/(kg·d)；LF3：乳鐵蛋白2 000 mg/(kg·d)。A:IGF-Ⅰ mRNA; B:IGFBP-3 mRNA; C:IGFBP-5 mRNA。與Con組比較，●：P<0.01，△：P<0.05。圖3 干預6個月后各組IGF-Ⅰ, IGFBP-3及IGFBP-5 mRNA相對表達量Fig.3 The local expression of IGF-Ⅰ, IGFBP-3 and IGFBP-5 mRNA after 6 months of treatment

3 討 論

骨質疏松是以骨吸收大于骨形成而出現骨密度降低、骨微結構破壞的慢性全身代謝性骨病。研究表明，LF可通過抑制骨吸收，促進骨形成而減少骨丟失[4]。本研究使用不同劑量的LF干預去卵巢后骨質疏松模型大鼠，觀察其對骨量變化的影響及其可能的分子生物學機制。

LF在體外能夠刺激成骨細胞的增殖和分化，8.5和85.0 mg/kg濃度的干預條件下，LF可增加骨的機械強度和骨密度[6]。有研究表明，口服LF促骨形成作用是通過調整骨微結構而實現[7]。與對照組比較，LF干預組的骨小梁數目增多，腰椎和股骨的骨體積增大，骨小梁厚度增加，骨密度增高。LF濃度為1 000和2 000 mg/(kg·d)條件下，骨質疏松模型大鼠骨密度顯著增加。Cheng等[8]發現，LF可以通過刺激成骨細胞增殖而增加骨量，卻對破骨細胞活性無明顯影響，即該作用并非通過抑制骨吸收而實現。本研究在光鏡下觀察脛骨干骺端橫截面發現，LF1～LF3組骨小梁密度較Con組致密，但不如E2組和Sham組顯著。采用Image-Pro Plus 6.0分析各組骨小梁面積占骨髓腔比例可見，E2、Sham和LF1～LF3組的比值均顯著高于Con組，但LF1～LF3組均不及Sham組和E2組明顯，推測LF增加骨量的作用雖不如雌激素明顯，但也可在一定程度上抑制骨吸收、促進骨形成。

IGF系統包括IGFs (IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ)、IGFs受體和IGFBPs。Cornish等[9]的研究發現，IGF-Ⅰ是保持骨骼穩態至關重要的細胞因子，它可通過與成骨細胞的IGF-ⅠR結合，從而激活p42/44 MAPK和PI3K介導的信號通路，最終促進成骨細胞的增殖和分化。有研究表明，口服LF對骨吸收標志物的抑制作用可能通過上調IGF-Ⅰ mRNA實現，減少因去卵巢引起的骨量丟失[4]。體外實驗中，LF可通過IGF-Ⅰ/IGF-ⅠR通路刺激成骨細胞增殖及骨形成；同時，LF可通過上調IGF-Ⅰ的表達發揮抑制成骨細胞凋亡的作用[4-5]。在以老年骨質疏松模型(SAMP6小鼠)和衰老成骨細胞為對象的研究中，LF可促進堿性磷酸酶、IGF-Ⅰ等成骨細胞標志物表達而促進成骨細胞增殖，并通過降低p16和p21延緩衰老，起到抗氧化應激作用[10]。

本研究中，與Con組比較，LF1～LF3組IGF-Ⅰ mRNA的表達顯著升高。Sjogren等[11]發現，由肝臟分泌的IGF-Ⅰ減少導致的骨量損失非常小，而循環中的IGF-Ⅰ水平降低導致的骨量減少所占比例卻高達75%。Gao等[12]發現，局部應用LF可促進大鼠顱骨缺損模型的骨再生。Govoni[13]選擇性基因敲除小鼠目標組織周圍IGF-Ⅰ，使其表達量降低而導致骨量下降。在該研究中，骨組織和肝臟組織周圍IGF-Ⅰ減少均可出現骨密度和骨小梁體積下降，前者較后者更為明顯。而Zhao等[14]發現，過表達IGF-Ⅰ在不改變成骨細胞數量的情況下可增加松質骨量。以上研究均表明，循環或骨組織周圍IGF-Ⅰ的增加導致促骨形成，較其他組織釋放過多的IGF-Ⅰ促骨形成作用更為明顯。

不論在細胞培養液中還是在體內，IGFs都結合其調節蛋白并以無活性的復合物形式存在。目前已發現6種IGFBP(IGFBP-1，IGFBP-2，IGFBP-3，IGFBP-4，IGFBP-5，IGFBP-6)。IGFBP-1，IGFBP-2，IGFBP-4及IGFBP-6通過與IGF結合形成具有抑制作用的二級復合物(IGFs-IGFBPs)，該復合物能夠穿過血管內皮細胞，并能被特定的蛋白酶水解，最終在循環中更容易被降解；而IGFBP-3和IGFBP-5主要通過與IGF-Ⅰ形成三級復合體而發揮作用。因此，復合體難以通過血管內皮細胞而聚集在組織周圍。此時，IGFBP-5或IGFBP-3通過與細胞表面和細胞外基質結合而降低與IGF的親和力，從而使IGF受體附近IGF的局部濃度增加[6]。IGFBP-3和IGFBP-5也具有獨立于IGFs的作用：IGFBP-5可通過與細胞核或細胞膜表面IGFBP-5特異性受體結合而獨立于IGF-Ⅰ發揮促進骨形成作用，這種現象并非需要通過增加血清IGF-Ⅰ水平而實現[15]。在體外實驗中，IGFBP-5是唯一一種可持續刺激成骨細胞增殖的IGF結合蛋白[16]。本研究中，雖然不同LF組的IGFBP-5 mRNA水平均高于Con組，但這些升高僅在LF2～LF3組有統計學意義(P<0.05和P<0.01)，提示LF可能通過促進IGFBP-5 mRNA表達而增加骨量。與E2組和Sham組比較，Con組的IGFBP-3 mRNA水平顯著降低(P<0.01)，而LF1～LF3組中IGFBP-3 mRNA表達水平更低(P<0.01)。Silha等[17]的研究提示，過表達IGFBP-3可增加破骨細胞的數量而促進骨吸收、抑制骨形成。Baumrucker等[18]的研究表明，在細胞外的LF可使IGFs與IGFBP-3的結合解離，并與IGF-Ⅱ競爭性地結合IGFBP-3，而不結合IGFBP-5。這也許能解釋在LF干預后IGFBP-3 mRNA表達下調的原因，并提示LF增加骨量的作用可能是通過抑制IGFBP-3 mRNA表達水平而實現。

雌激素可通過影響體內的某些激素水平和進食量來控制體質量，并增加脂肪中瘦素的表達而抑制脂肪細胞的形成[19]。本研究中，E2及Sham組體質量的增量遠小于其他組，說明雌激素可控制因去卵巢所致的體質量增加。雌激素作為防治絕經后骨質疏松的藥物已應用于臨床多年。雖然LF能增加骨組織IGF-Ⅰ mRNA的表達，并可能減少因長期使用雌激素而出現的副作用，卻無法控制大鼠去卵巢后體質量的增加。

綜上所述，LF可在一定程度減少去卵巢大鼠骨丟失，促進股骨IGF-Ⅰ和IGFBP-5 mRNA的表達，抑制IGFBP-3 mRNA的表達，這也許能作為LF治療骨質疏松的一個重要因素。如果能進一步研究在LF干預下IGF-Ⅰ、IGFBP-3和IGFBP-5調控骨量的下游信號通路之間的關系，將給臨床提供更多治療骨質疏松的思路。