鈦表面多級微納米復合結構羥基磷灰石涂層的構筑及其生物活性研究

胡 駿， 施 斌， 陳艷文， 丁玉梅

骨作為人體重要的硬組織，具有極其復雜的多級結構，使得其展現出優異的機械性能和生物性能[1]。人體骨組織是以膠原為主的有機相和以納米羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)為主的無機相共同組成的多級微/納米結構[2-3]。從生物仿生學角度看，由多級微米級及納米級形貌復合所形成的獨特表面形貌能更加有效地模擬自然狀態下的骨形態及骨功能。研究表明，材料表面的形貌和成分對植入人體后蛋白吸附及細胞的粘附、生長、增殖、分化等功能有著較大的影響[4-7]。因此，構造一種具有多級微/納米形貌及生物活性表面，對于骨組織的生長和形成骨整合，實現材料植入后的短期負載和長期安全有著積極的意義。

本研究擬在純鈦表面采用噴砂酸蝕的方式構筑多級微米形貌，在保留多級微米表面的同時通過陽極氧化形成納米級的微結構，通過電化學沉積及熱處理調控沉積形成具有生物活性的HA涂層，構筑多級微納米復合結構HA涂層，優化鈦表面生物活性，促進鈦植入體表面與骨組織的骨整合。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料與試劑 TA4鈦片(大博醫療科技股份有限公司)；人成骨細胞MG-63(廈門大學陳清西實驗室惠贈)；RPMI 1640培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(德國PAA公司)；0.25%胰酶消化液(美國Gibco公司)；其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1分組 選用TA4鈦片(1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm)，依次采用320#、1000#氧化鋁砂紙逐級打磨至表面平整無毛刺，依次置于丙酮、乙醇、去離子水中超聲清洗10 min，在含有HNO3及HF的水溶液中酸洗2 min，去離子水沖洗，烘干至恒重，待用。將研究樣品分為4組：

1.2.1.1酸洗(PT組) HNO3∶HF=150 mL/L∶40 mL/L的水溶液中酸洗2 min。

1.2.1.2表面噴砂酸蝕(SLA組) 酸洗后，噴砂及混合酸處理工藝同文獻方法[8]，即采用180目(0.08 mm)Al2O3噴砂后，于硫酸/鹽酸的混合液中60 ℃下酸蝕30 min。

1.2.1.3SLA-A組 酸洗后，噴砂及混合酸處理，隨后進行陽極氧化處理(20 V電壓，濃度0.3%HF，陽極氧化6 min)。

1.2.1.4SLA-A-E-H組 噴砂酸蝕陽極氧化后，以樣片為陰極進行恒電流電化學沉積[Ca(NO3)2∶NH4H2PO4=1.68∶1，沉積電流：2×10-2A/cm2，55 ℃，60 min]，隨后置于管式加熱爐中加熱處理(500 ℃，升溫速率8 ℃/min，保溫3 h)，冷卻至室溫，此處理定義為SLA-A-E-H組。

1.2.2表面形貌及表征分析 采用SEM對材料表面進行形貌觀察；采用掃描電鏡LEO1530所附帶的Oxford能量散色光譜儀進行成分表征和結晶相測試；采用X射線衍射儀進行涂層結構成分測試；采用拉曼光譜儀和衰減全反射傅里葉變換紅外光譜儀進行表面紅外光譜表征分析。

1.2.2.1 菌株DNA提取過程（1）稱取純種麩曲0.5 g，置于2 mL離心管中。（2）向離心管中加入1 mL裂解液，漩渦充分混勻。

1.2.3粗糙度及親水性分析 采用表面粗糙度儀對材料表面進行粗糙度表征；采用光學接觸角測量儀進行表面接觸角測試。樣品處理后放置5 d，再進行親水性測試表征。

1.2.4體外生物活性研究 采用體外礦化實驗進行體外生物活性測試，使用的模擬體液(simulated body fluid, SBF)參考Kokubo[9]的配方及方法，采用Millipore公司Milli-Q型制備的膜過濾超純水。配制方法為恒溫水浴(36.5±1.5)℃條件下，依次按順序逐一溶解相應溶質后，用1.0 mol/L的HCl和Tris溶液調節pH值=7.40，定容。樣品浸泡SBF，溶液體積量為50 mL，恒溫水浴36.5 ℃下浸泡7 d后取出，用去離子水沖洗后干燥待用。

1.2.5成骨細胞粘附實驗 將處理完的樣品置于12孔板內，每個孔內放1個樣品。取生長對數期的成骨細胞MG-63，用PBS溶液洗滌2次，0.25%胰酶消化后，用完全培養基制成單細胞懸液，計數后調整細胞濃度為每孔1×105接種于12孔板內，置于37 ℃、體積分數為0.05的CO2培養箱中培養。培養48 h后換液，繼續培養72 h。樣品用0.1 mol/L預冷的PBS沖洗3次；2.5%戊二醛4 ℃下固定2 h后，0.1 mol/L 預冷的PBS沖洗3次；分別以30%，50%，70%，90%及100%的乙醇依次梯度脫水，每次10 min；最后過渡到100%叔丁醇中，4 ℃過夜結晶；冷凍干燥后，噴金處理，掃描電鏡觀察。

2 結 果

2.1表面形貌和成分分析 采用SEM對PT、SLA、SLA-A、SLA-A-E-H 4種不同方法處理的鈦片樣品進行表面形貌表征(圖1)。PT組表面形成略帶起伏、無細微結構的平整表面；SLA組表面形成孔徑為5～8 μm及20～30 μm、有一定深度的多級微米孔洞；SLA-A組表面在保留多級微米孔洞的同時，原位形成10 nm的管狀納米形貌；SLA-A-E-H組在多級微納米表面鋪展了一層寬30～50 nm、長100～200 nm納米梭形顆粒所組成的膜層，即擁有多級微納米復合結構的表面涂層。表面元素分析結果顯示，PT組和SLA組表面元素種類無變化，SLA-A組表面出現氧元素，SLA-A-E-H組表面不僅引入氧元素，還有鈣和磷元素(圖2)。

A,B：酸洗；C,D：噴砂酸蝕；E,F：陽極氧化；G,H：電化學沉積羥基磷灰石及熱處理。A，C，E，G：×3 000；B，D，F，H：×30 000。圖1 不同方法處理后的表面掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of surface treated in different ways

A：酸洗；B：噴砂酸蝕；C：陽極氧化；D：電化學沉積羥基磷灰石及熱處理。圖2 鈦表面經過不同處理后表面能譜分析譜圖Fig.2 EDS of surface treated in different way

2.2表面晶型分析 X射線衍射分析結果如圖3所示。PT及SLA組的衍射與鈦(JCPDS#89-5009)的標準卡片相符，表明表面無其他膜層覆蓋，為純鈦基體表面。酸蝕后(102)晶面及(110)晶面分別存在一定減弱和增強，說明酸蝕存在一定程度的特異性腐蝕，在2θ=59.2°出現明顯的衍射峰，為析氫產生的TiH2物相。SLA-A組由于生成的二氧化鈦無定形，故僅有鈦基體的峰存在。

a：酸洗；b：噴砂酸蝕；c：陽極氧化；d：電化學沉積羥基磷灰石及熱處理。圖3 不同處理后樣品的X射線衍射譜圖Fig.3 XRD patterns of the surface treated in different ways

2.3表面紅外圖譜及拉曼光譜分析 PT、SLA及SLA-A組的紅外譜圖基本無明顯變化(圖4A)，僅SLA-A-E-H組在3 400 cm-1處可見微弱的峰，同時在1 026 cm-1處出現一個峰型尖銳的強峰，對應為磷灰石PO43-的反對稱伸縮振動峰(ν3)[10]，而SLA-A-E-H表面特征峰不明顯。

A：紅外譜圖；B：拉曼譜圖。PT：酸洗；SLA：噴砂酸蝕；SLA-A：陽極氧化；SLA-A-E-H：電化學沉積羥基磷灰石及熱處理。圖4 不同處理樣品的紅外及拉曼譜圖Fig.4 ATR-FTIR and Raman spectra of different surface treatments(PT, SLA, SLA-A, SLA-A-E-H)

4種樣品的拉曼譜圖如圖4B所示。PT、SLA、SLA-A組均無明顯的拉曼峰出現，SLA-A-E-H組在148，198，395，518及640 cm-1處出現較明顯的銳鈦礦特征譜峰，同時在448及830 cm-1處出現金紅石的特征譜峰[11]。

2.4粗糙度比較 酸洗后PT， SLA，SLA-A及SLA-A-E-H組的表面粗糙度分別為(0.62±0.02)，(1.65±0.16)，(1.64±0.06)及(1.63±0.05)μm(圖5)。統計顯示，PT組與其他組(SLA, SLA-A, SLA-A-E-H)的差別均有統計學意義(P<0.05)；SLA，SLA-A及SLA-A-E-H組間差別無統計學意義(P>0.05)。

PT：酸洗；SLA：噴砂酸蝕；SLA-A：陽極氧化；SLA-A-E-H：電化學沉積羥基磷灰石及熱處理。與PT組比較，△：P<0.05。圖5 不同處理后的樣品表面粗糙度Fig.5 Surface roughness of samples after different treatments

2.5接觸角比較 PT，SLA，SLA-A及SLA-A-E-H組的測試接觸角分別為(68.0±0.4)°，(88.7±2.1)°，(134.2±2.7)°及(60.4±0.45)°(圖6)。

A：酸洗；B：噴砂酸蝕；C：陽極氧化；D：電化學沉積羥基磷灰石及熱處理。圖6 不同處理后的樣品接觸角Fig.6 Contact angle of samples after different treatments

2.6體外生物活性研究-體外礦化實驗 PT，SLA及SLA-A組表面均無礦化結晶產生，僅SLA-A-E-H組表面礦化生成大量的沉淀物(圖7)。

A：酸洗；B：噴砂酸蝕；C：陽極氧化；D：電化學沉積羥基磷灰石及熱處理。圖7 不同處理后的樣品浸泡SBF溶液7 d后掃描電鏡圖(×10 000)Fig.7 SEM images of samples treated in different ways soaking in SBF for 7 d(×10 000)

為確定礦化物質的性質，對SLA-A-E-H組浸泡7 d 的表面涂層進行成分表征分析及元素含量分析。表面礦化物由鈣、磷、氧元素組成，其中鈣磷比約為2.0～2.2，大于羥基磷灰石的鈣磷比理論值1.67(表1)。

表1 SLA-A-E-H樣品SBF浸泡7 d后表面成分Tab.1 Composition of SLA-A-E-H soaking in SBF for 7 d

為進一步確定其礦化成分，對上述SLA-A-E-H浸泡前及浸泡7 d后的樣品進行XRD及ATR-FTIR表征。浸泡前在2θ=25.2°,27.4°,32.1°及其他位置分別對應金紅石、銳鈦礦、微弱的HA峰及鈦基體的特征衍射峰，浸泡后金紅石和銳鈦礦的峰基本消失，但在2θ=25.9°及32.1°附近出現明顯的羥基磷灰石的衍射峰[13](圖8A)。

對上述樣品進行ATR-FTIR測試表征(圖8B)。浸泡前在1 025 cm-1處出現較弱的磷灰石PO43-的反對稱伸縮振動峰(ν3)，同時在3 570 cm-1處出現OH-的伸縮振動。浸泡后，在1 025 cm-1處對應磷酸根的峰面積均有較大程度增加[14]。此外，SBF浸泡常伴隨CO32-的取代，紅外光譜定性檢測可見1 420 cm-1處出現CO32-的紅外吸收峰。

SLA-A-E-H：電化學沉積羥基磷灰石及熱處理；XRD：X射線衍射；ATR-FTIR：紅外光譜;SBF:模擬體液。A：XRD；B：ATR-FTIR。圖8 SLA-A-E-H樣品模擬體液浸泡前后的XRD及ATR-FTIRFig.8 XRD and ATR-FTIR image of SLA-A-E-H soaking in SBF

2.7體外細胞粘附實驗 PT組表面的細胞大小約為20 μm，細胞周圍存在大量偽足，微絨毛很少。SLA組明顯可見噴砂酸蝕形成的多級微米結構上粘附大量的成骨細胞，細胞呈多邊形，微絨毛較PT組有較大程度的增加，放大后可見細胞偽足吸附在微米孔洞中。SLA-A組保留多級微米形貌的同時形成微小納米結構，與SLA組表面細胞形態基本相同，存在大量偽足。相比之下，其偽足和微絨毛進一步增加。SLA-A-E-H組表面的表征形態與SLA-A及SLA-A-H組相似，但其微小絨毛的數量顯著增加(圖9)。

A,B：酸洗;C,D：噴砂酸蝕; E,F：陽極氧化;G,H：電化學沉積羥基磷灰石及熱處理。A，C，E，G：×1 000；B，D，F，H：×10 000。圖9 不同處理后的樣品細胞培養3 d后的掃描電鏡圖Fig.9 SEM images of samples treated in different ways for 3 d

3 討 論

根據鈦片表面形貌尺度不同，表面形態可分為微米級、納米級，不同的表面形貌對植入材料與細胞、蛋白之間的生物行為有一定的調控作用。通常微米形貌可通過噴涂、噴砂、酸蝕等方法制備，納米形貌則可通過自組裝、化學浸泡NaOH或H2O2陽極氧化等方法獲得。研究表明，微米表面對植入體的植入效果有一定的影響：如增加材料與骨的基礎面積，利于細胞粘附，改變細胞的組織行為，增加植入體與骨之間的機械鎖合以及促進植入毗連區的炎癥反應利于其愈合等。納米結構則通過增加或改變蛋白的吸附行為，影響細胞的相互作用，從而間接影響細胞的行為，促進成骨細胞的粘附、增殖、分化以及骨的形成，在一定程度上促進細胞某些功能的實現。

本研究在平整純鈦表面，選用4種方法(PT，SLA，SLA-A及SLA-A-E-H組)進行處理，獲得不同的表面形貌。對這4種表面涂層采用能譜分析進行成分表征，結果顯示，PT及SLA組表面無其他元素的能譜峰，SLA-A組出現一定含量的氧元素，說明陽極氧化處理在表面形成相應鈦的氧化物；SLA-A-E-H組除了鈦的氧化物，還存在一定含量的鈣、磷元素，其中鈣原子含量略高于磷，說明沉積的梭形納米顆粒為含有鈣、磷等元素的鈣磷鹽。SLA-A-E-H組在2θ=25.2°及27.4°出現兩個較強的衍射峰，說明通過熱處理，可在表面形成相應的銳鈦礦和金紅石的結晶氧化鈦層；同時，發現SLA-A-E-H組在2θ=32.1°存在一個較微弱的衍射峰，與標準HA的衍射數據(JCPDS#01-1008)相吻合，表明生成的成分為HA，但其結晶度較低。

表面紅外圖譜分析結果顯示，PT，SLA及SLA-A組紅外譜圖基本無明顯變化，僅SLA-A-E-H組在3 400 cm-1處出現微弱的峰，說明有締合的羥基紅外吸收峰，同時在1 026 cm-1處出現一個峰型尖銳的強峰，對應為磷灰石PO43-的反對稱伸縮振動峰(ν3)[10]；而SLA-A-E-H表面特征峰不明顯，說明形成HA的結晶性相對較低，結果與X射線衍射數據一致。

拉曼譜圖譜結果顯示，PT，SLA及SLA-A組均無明顯的拉曼峰出現，SLA-A-E-H組有較明顯的銳鈦礦特征譜峰，同時在448 及830 cm-1處出現了金紅石的特征譜峰[11]，與X射線衍射數據一致。文獻報道，在966，591及430 cm-1處會出現較明顯HA中的磷酸根中P-O的對稱伸縮振動及彎曲伸縮振動[12]，而拉曼譜圖中591及430 cm-1處對應的磷酸根中P-O的彎曲伸縮振動幾乎消失，僅966 cm-1處出現微弱的P-O伸縮振動峰。這是由于拉曼光譜中散射峰的分裂現象不明顯，說明表面形成的HA的結晶度較低，HA的含量較少，導致其信號比較微弱，也與X射線衍射、紅外光譜測試結果一致。

樣品紅外光譜測試表征顯示，浸泡后，在1 025 cm-1處對應磷酸根的峰面積均有較大程度的增加[14]，說明HA含量有一定程度的增加。此外，SBF浸泡常伴隨CO32-的取代，紅外光譜可做定性檢測，其中1 420 cm-1處出現了CO32-的紅外吸收峰，說明浸泡SBF后形成的HA中含有CO32-，并發生了部分取代[15]。

樣品經過噴砂處理，在獲得多級微米形貌時，其表面與未處理表面相似(均<90°)，為親水型表面。在此基礎上進行納米化構造，其初始獲得了超親水型的表面，說明在未飽和吸附有機污染物的情況下，獲得的無定型氧化鈦微納米結構具有超親水性，在5 d吸附后呈現疏水狀態。經電化學沉積HA和熱處理后，其親水性下降，說明在表面成分對親疏水性有一定的影響，但仍然呈現親水性狀態。

筆者通過多種表征方式證實，SLA-A-E-H組的樣品表面形成了微/納米結構，并增加納米HA及結晶型金紅石、銳鈦礦型氧化鈦成分，有利于細胞功能的實現，提高生物學活性。

對樣品進行體外活性研究，SBF浸泡后，SLA及SLA-A組表面雖然具有多級微米及微納米形貌，但礦化能力較弱，無法礦化形成HA；而SLA-A-E-H組取得顯著的效果，說明表面成分對礦化的影響較大。多級微納米結構及納米HA的構筑使其表面體外生物活性顯著增加，其原因有兩方面：(1)通過構造多級微納米形貌，使得其比表面積大幅度增加，增加了單位面積上的活性位點，從而為浸泡過程中的HA的結晶形核提供了更多的位點；(2)結晶相的氧化鈦及電化學沉積的HA顆粒其本身生物活性良好，且結晶性良好，因而能為形核提供晶核，大幅縮短了表面礦化沉積部分取代HA的礦化時間。

材料表面的化學成分可以影響蛋白的吸附，從而對表面信號傳導，細胞粘附、生長及組織響應有著直接的影響。涂層表面的形貌及成分對成骨細胞的貼壁情況及粘附生長狀況均有較大的影響，一定程度上反映不同處理表面的生物活性。本研究中，體外細胞培養也顯示出相似的結果。相比于平整的鈦表面，多級微米形貌上生長的成骨細胞能部分生長在微米孔內或孔上，其偽足及微絨毛也能大量吸附在表面的微米結構上，隨后通過引入納米形貌，在表面成分有一定改變的條件下，其微絨毛有較大程度的增加，原因可能是納米孔之間存在一定程度內部貫通，更加有利于某些營養成分的輸送及存儲，同時納米結構的存在也使比表面積有較大程度的提高，增加了細胞與表面的接觸面積，從而有利于成骨細胞在其表面的生長。活性納米HA的引入又進一步提高了其生物相容性和活性，導致細胞表面微絨毛數量增加，從而增加與細胞的附著，也利于后期組織的生物礦化，形成材料與骨組織的骨性結合。

綜上所述，對鈦表面通過混合酸的噴砂酸蝕、陽極氧化可構筑孔徑為5～8及20～30 μm多級微米孔洞及10 nm的管狀納米形貌，進一步電化學沉積及熱處理復合寬度為30～50 nm、長度100～200 nm梭形納米HA顆粒所組成的多級微納米復合結構HA涂層，這種復合涂層體外活性高，可促進成骨細胞粘附，有望進一步開發應用于鈦硬組織替代植入材料。