葡萄籽原花青素對羔羊瘤胃發酵、血清炎癥及抗氧化指標的影響

郝小燕，牟春堂，喬棟，張暄梓，楊文軍，趙俊星，張春香，張建新?

1山西農業大學動物科學學院，山西太谷 030801；2朔州市草牧業發展中心，山西朔州 036002

0 引言

【研究意義】在生態保護日益受到重視的背景下，傳統畜牧業逐漸向先進的集約化飼養模式轉變。我國優質粗飼料較為短缺，反芻動物生產中大量使用高谷物飼料以維持或提升生產性能。高精低粗的飼糧結構雖能提高育肥牛羊的生長速度，提高奶牛、奶山羊的產奶量，但長期飼喂高谷物飼糧引發的健康問題不容忽視。因此，研究高精料飼糧條件下調控瘤胃發酵、保護機體免受氧化損傷的措施對反芻動物健康、高效養殖具有重要意義。【前人研究進展】侯志高等[1]研究發現不同精料濃度飼糧對瘤胃內環境穩定和機體氧化應激有顯著影響，精料比例在55%時瘤胃內超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力最高，丙二醛（MDA）含量最低，清除自由基的能力最強。而隨著精料比例增加，瘤胃內環境穩態被破壞，抗氧化能力顯著下降，抵抗不良刺激的能力下降，故高精料飼糧下機體容易發生一系列代謝性、炎性疾病。原花青素（proanthocyanidins，PC）是自然界中廣泛存在的植物多酚類化合物，由不同數量的兒茶素或表兒茶素聚合而成。有關研究表明原花青素可以增強動物機體抗氧化能力，調節機體免疫反應，進而改善動物健康狀況、促進生長[2-3]。也有研究報道原花青素可以促進機體正常細胞生長，如胃黏膜細胞[4]；可以降低脂質過氧化、DNA片段化及細胞膜微黏度，通過抗組胺作用來降低氧化應激引起的胃腸道黏膜損傷[5]；對結直腸炎、結直腸癌有一定的防護作用[6]；長期食用原花青素能夠緩解內毒素對結腸屏障完整性的損傷和抑制胃腸道對內毒素的吸收[7]；可以減輕機體炎癥腫脹，抑制細胞因子IL-6和TNF-α誘導的血管細胞黏附分子-1的表達水平[8]。另外，原花青素對瘤胃發酵、微生物區系也有一定的調控作用[9-10]。杜宇等[11]研究發現在體外建立的亞急性瘤胃酸中毒模型中添加4.5%石榴多酚可以提高發酵液pH，降低發酵液中揮發性脂肪酸（VFA）、內毒素（LPS）和組胺濃度，同時降低牛鏈球菌數量和乳酸濃度。郭長征等[12]研究表明高精料飼糧中添加另一種多羥基黃酮類化合物（槲皮素）可以提高山羊瘤胃 pH，提高血清抗氧化能力，但有關植物多酚對瘤胃組織抗氧化和抗炎能力的影響及機制的研究較少。【本研究切入點】基于高精料飼糧對動物瘤胃、機體的危害及原花青素抗氧化、抗炎的生物學功能，本研究提出適宜劑量的葡萄籽原花青素可以通過調控瘤胃發酵和改善機體抗氧化能力而減輕機體氧化損傷的假設。【擬解決的關鍵問題】本試驗研究了高精料飼糧條件下，添加不同水平葡萄籽原花青素（GSPs）對羔羊生長性能、瘤胃發酵、瘤胃及血清炎癥因子及抗氧化能力的影響，為葡萄籽原花青素在反芻動物生產中的應用提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

葡萄籽原花青素購自南京澤朗生物科技有限公司，純度≥96%。

試驗選用48只體重相近（22.75±1.20 kg）、月齡相近的杜泊×小尾寒羊雜交公羔，采用單因素完全隨機試驗設計，將48只羔羊隨機分為4組，每組12只。基礎飼糧精粗比為70:30，GSPs添加量分別為0（對照組，CON）、10（10GSPs）、20（20GSPs）、40（40GSPs）mg·kg-1BW。預飼15 d，飼糧精粗比從4∶6逐漸過渡到7∶3，正試期45d。正試期每日晨飼前，用分析天平稱取每日每只羊 GSPs飼喂量，與 100 g粉狀飼糧混合后，逐只一次性飼喂，以保證完全攝入，GSPs的飼喂量每周根據體重調整一次。試驗羔羊全部單欄（3.0 m×0.8 m）飼養，飼糧采用全混合顆粒飼料，每天飼喂2次（07:00和19:00），自由采食，自由飲水。試驗羊舍通風良好，平均溫度23.7℃，平均相對濕度59%，基礎飼糧組成及營養水平見表1。

表1 飼糧組成及營養水平（干物質基礎）Table 1 Composition and nutrient level of diets (dry matter basis, %)

1.2 樣品采集

正試期第一天早6:00對所有試驗羊空腹稱重，作為初始體重，之后每隔15 d稱重一次，記錄體重數據。試驗期間記錄每只羊的日采食量、剩料量，正試期結束后計算平均日增重（ADG）、平均日采食量（AFDI）及料重比（F/G）。正試期第45天晨飼前頸靜脈采血，常規方法分離血清后-20℃保存待測。

正試期結束當天18:00，每組隨機選擇6只禁食、禁水12 h，次日6:00進行屠宰。采集瘤胃背囊組織，迅速用磷酸緩沖鹽溶液反復清洗，剪碎后立即置于液氮中速凍保存，采樣結束后放于-80℃保存。

正試期結束后連續3 d通過口腔采集每組剩余6只羊的瘤胃液，分別于飼喂后1、3、4、6、8、12 h通過口腔采集瘤胃液（每天采2個時間點，第一天：8:00、13:00，第二天：10:00、15:00，第三天：11:00、19:00），棄掉初始采集含有較多黏液的部分，立即測定瘤胃液pH；同時分裝樣品于-20℃保存待測瘤胃發酵指標。

1.3 指標測定

瘤胃組織和血清抗氧化能力測定所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，具體指標包括總抗氧化能力（T-AOC）、SOD、過氧化氫酶（CAT）、GSH-Px、MDA。采用酶聯免疫吸附（ELISA）法測定瘤胃組織及血清中IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ含量，ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

飼喂后3 h的瘤胃液樣品用于測定VFA和LPS濃度。VFA濃度測定采用氣相色譜法，具體操作參照嚴淑紅等[13]的方法。使用顯色基質鱟試劑盒（廈門鱟試劑實驗廠有限公司）測定瘤胃液和血清中的LPS濃度[14]。

1.4 數據分析

利用Excel 2010版進行試驗數據初步整理，采用SAS 9.2軟件中 one-way ANOVE進行分析，采用Duncan法進行多重比較，通過正交多項式分析處理的線性和二次效應。P＜0.05表示為差異顯著，P＜0.10表示有顯著的趨勢。

2 結果

2.1 生長性能

羔羊生長性能數據已發表[15]，具體見表 2，試驗羔羊的初始體重相近，但飼糧中添加不同水平 GSPs后羔羊末重（P=0.039）、ADG（P=0.005）、ADFI（P=0.001）呈二次方效應，其中 10GSPs和 20GSPs組的末體重顯著高于對照組（P＜0.05），與 40GSPs差異不顯著（P＞0.05）；10GSPs和20GSPs組ADG和ADFI顯著高于對照組和40GSPs組（P＜0.05），而40GSPs組與對照組差異不顯著（P＞0.05）。飼糧中添加GSPs對料重比沒有顯著影響（P＞0.05）。

表2 高精料飼糧中添加葡萄籽原花青素對羔羊生長性能的影響Table 2 Effect of GSPs supplemented in high-concentrate diet on growth performance of lambs

2.2 瘤胃pH和揮發性脂肪酸

由表3可知，與對照組相比，添加GSPs對瘤胃pH有一定的調控作用。飼喂后3、8、12 h瘤胃pH隨GSPs的添加線性升高，20GSPs和40GSPs組瘤胃pH顯著高于對照組和10GSPs組（P＜0.05）。飼喂后4 h瘤胃液 pH較對照組有線性升高趨勢，但差異不顯著（P=0.057）。

表3 高精料飼糧中添加葡萄籽原花青素對羔羊瘤胃pH的影響Table 3 Effect of GSPs supplemented in high-concentrate diet on rumen fluid pH of lambs

從表4可見，飼糧中添加GSPs后羔羊采食后3 h瘤胃液中乙酸（P=0.058）和丁酸（P=0.064）濃度有降低的趨勢，對丙酸、異戊酸和戊酸濃度沒有顯著影響（P＞0.05）。40GSPs組異丁酸濃度顯著高于對照組和10GSPs組（P＜0.05），與20GSPs組差異不顯著（P＞0.05）。隨著GSPs添加量的增加，總揮發性脂肪酸濃度有線性下降的趨勢（P=0.062）。飼糧中添加GSPs對乙酸/丙酸值沒有顯著影響（P＞0.05）。

表4 高精料飼糧中添加葡萄籽原花青素對羔羊飼喂后3 h瘤胃揮發性脂肪酸的影響Table 4 Effect of GSPs supplemented in high-concentrate diet on rumen VFA after feeding 3 hours of lambs

2.3 瘤胃液和血清內毒素含量

由表5可見，高精料飼糧中添加GSPs瘤胃液LPS含量的呈線性和二次方下降趨勢，其中 20GSPs數值最低，但差異不顯著（P=0.076）；20GSPs和40GSPs組血清LPS濃度較對照組和10GSPs組顯著降低（P＜0.0001）。

表5 高精料飼糧中添加葡萄籽原花青素對羔羊飼喂后3 h瘤胃液脂多糖含量的影響Table 5 Effect of GSPs supplemented in high-concentrate diet on rumen LPS content after feeding 3 hours of lambs

2.4 瘤胃和血清抗氧化能力

由表6可見，高精料飼糧中添加GSPs線性提高了瘤胃GSH-Px活性，線性降低瘤胃組織MDA水平（P＜0.05）。20GSPs和40GSPs組GSH-Px活性顯著高于對照組和10GSPs組，MDA含量顯著低于對照組和 10GSPs組（P＜0.05）。對于血清抗氧化指標，20GSPs和 40GSPs組 SOD活性顯著高于對照組，GSH-Px活性顯著高于對照組和10GSPs組（P＜0.05）。添加GSPs有線性降低血清MDA（P=0.059）和提高T-AOC（P=0.060）的趨勢。

表6 高精料飼糧中添加葡萄籽原花青素對羔羊瘤胃和血清抗氧化指標的影響Table 6 Effect of GSPs supplemented in high-concentrate diet on rumen and serum antioxidant indicators of lambs

2.5 瘤胃和血清炎性因子水平

由表7可見，飼糧中添加GSPs對瘤胃組織炎癥因子水平沒有顯著影響，但有降低IL-6和IL-10的趨勢（P≤0.061）。20GSPs和40GSPs組血清TNF-α水平顯著低于對照組和10GSPs組（P＜0.05），IL-6水平有降低的趨勢，但差異不顯著（P=0.074）；40GSPs組血清 IL-10含量顯著低于對照組，與 10GSPs和20GSPs組差異不顯著（P＞0.05）。

表7 高精料飼糧中添加葡萄籽原花青素對羔羊瘤胃和血清炎癥因子的影響Table 7 Effect of GSPs supplemented in high-concentrate diet on rumen and serum inflammatory factors of lambs

3 討論

原花青素是植物體內重要的次生代謝產物，是一類植物多酚類化合物。葡萄籽原花青素主要存在于葡萄籽、葡萄皮和梗部，是一類重要的天然抗氧化劑。研究表明，原花青素類植物多酚在提高動物生產性能、免疫功能、抗氧化能力等方面發揮著重要作用，但高濃度的植物多酚可能會抑制動物采食量，擾亂消化生理，抑制營養物質消化和機體生長[16-19]。趙家奇等[18]研究發現在斷奶仔豬飼糧中葡萄籽原花青素可以顯著提高仔豬血清免疫球蛋白和補體含量，提高血清抗氧化酶活性，說明原花青素可以提高斷奶仔豬免疫力和抗氧化能力。在高溫熱應激條件下，飼糧中添加板栗多酚可以顯著提高肉雞日增重和采食量，提高肉雞抗氧化能力、緩解高溫熱應激[20]。金亞倩等[21]在綿羊飼料中添加葡萄渣，試驗結果表明10%葡萄渣添加組較對照組日增重提高38%，可能是葡萄皮渣中的主要活性物質原花青素發揮了生物學功能，這與本試驗得到的結果一致。本試驗中，GSPs改善羔羊生長性能，一方面原因可能是 GSPs改善了機體抗氧化能力和免疫力，進而提高生長性能；另一方面原因可能與多酚類物質降低飼糧蛋白質降解率、提高蛋白利用率有關[17]。有關飼糧中 GSPs水平對羔羊飼糧蛋白瘤胃降解率的影響還有待進一步研究。40GSPs組采食量和日增重較另外兩個 GSPs添加組低，可能與高劑量多酚類物質抑制瘤胃微生物（尤其是纖維分解菌），降低飼料消化率有關[22-23]。楊德蓮等[9]研究也表明葡萄籽原花青素能夠顯著降低奶牛瘤胃體外發酵液中溶纖維丁酸弧菌和產琥珀酸絲狀桿菌的數量，降低體外發酵產氣量。本試驗中 GSPs對羔羊瘤胃微生物區系的影響還需進一步深入研究。

反芻動物長期采食高精料飼糧會導致瘤胃和后腸道pH下降和VFA積累，導致微生物代謝紊亂，從而產生大量的細菌內毒素。當瘤胃pH低于5.8，且持續時間大于3 h，則被認為發生了亞急性瘤胃酸中毒。本試驗中各處理組瘤胃液 pH在采食后不同時間點測定結果均高于5.8（除3 h對照組為5.80，10GSPs為5.79），提示試驗羔羊尚未處于亞急性瘤胃酸中毒狀態。但由于本試驗中瘤胃液pH是通過口腔插管采集，可能對試驗羊食道產生一定的刺激，影響了采食量，從而影響瘤胃pH。對照組和10GSPs組各時間點瘤胃pH低于6.2，添加20和40 mg·kg-1BW的GSPs可以在一定程度上提高瘤胃液pH，這與楊德蓮等[9,11]的研究結果相一致。瘤胃 pH升高有利于提高羔羊的營養物質消化率和日增重。研究表明在體外亞急性瘤胃酸中毒模型中添加石榴皮多酚提取物可以顯著抑制瘤胃液中牛鏈球菌的生長和繁殖[11]；在高精料飼糧中添加槲皮素可以提高山羊瘤胃pH和血清抗氧化酶活性，緩解亞急性瘤胃酸中毒[12]；在高精料飼糧中添加植物多酚和精油混合物，瘤胃pH低于5.6的時間較不添加組顯著降低（18 min和199 min）[24]。本試驗中，添加GSPs有降低乙酸和總揮發性脂肪酸的趨勢，可能是 GSPs對纖維分解菌有一定的抑制作用所致。杜宇等[10]的研究中石榴多酚對乙酸和丙酸均有顯著的抑制作用，而本試驗中丙酸濃度的降低沒有達到顯著水平，可能是添加劑量不同所致。前人研究也表明，單寧對瘤胃中溶纖維丁酸弧菌有顯著的抑制作用[25]，而乙酸和丁酸是溶纖維丁酸弧菌的主要代謝物，因此添加 GSPs后瘤胃液中丁酸濃度有所下降。GETACHEW等[26]報道，多酚可能通過抑制微生物的氧化磷酸化而影響微生物代謝，或與微生物外源酶或底物結合而抑制底物降解，進而抑制微生物發酵產酸。

高精料引起瘤胃和腸道后段pH下降，革蘭氏陰性菌崩解死亡釋放出大量的 LPS，LPS的積累導致瘤胃上皮和腸道黏膜屏障損傷，LPS通過損傷的屏障易位進入循環系統，從而啟動機體的免疫應答，激活巨噬細胞和白細胞產生一系列細胞因子，如TNF-α、IL-6[27]。本研究中添加GSPs后瘤胃液LPS濃度在數值上低于對照組，但統計學上沒有顯著差異。原因可能是GSPs對瘤胃pH的輕微調控作用尚且沒有緩解不耐酸革蘭氏陰性菌的死亡。但添加GSPs后血清LPS濃度顯著降低，說明GSPs提高了肝臟清除LPS的能力。眾多研究表明原花青素可以緩解多種因素導致的肝損傷，提高肝功能[28-29]。本團隊將進一步深入研究高精料飼糧中添加GSPs對羔羊肝功能的影響。

高精料可能導致反芻動物體內氧化和抗氧化作用失衡，使機體處于氧化應激狀態[1,30]。機體內氧化應激和炎癥的發生往往是伴隨發生，且促炎細胞因子的過表達正反饋促進氧化應激[31]。植物多酚能夠有效清除機體內多余的自由基，在抗氧化和抗炎方面有重要作用。DESCALZO等[32]報道，新鮮牧草中植物多酚含量較高，因此放牧牛體內抗氧化物質含量較舍飼牛更高，機體抗氧化能力、免疫力更強。GSPs具有很強的抗氧化和抗炎能力，是一種良好的外源性抗氧化劑。宿孝奇[33]研究表明 GSPs可以顯著提高泌乳早期奶牛機體抗氧化能力，降低血液中氧化代謝產物和酮體的含量。LI等[34]研究表明 GSPs可以有效緩解由三硝基苯磺酸誘導產生的小鼠急性結腸炎，主要是通過下調某些炎癥介質而起抗炎作用，能夠有效抑制炎性細胞浸潤，抑制機體的氧化損傷，減少促炎細胞因子產生，同時通過提高氧化損傷組織的修復能力，增加抗炎細胞因子分泌而發揮作用。GSPs能夠調節仔豬腸道黏膜NF-κB和Nrf2的活性，抑制仔豬腸道炎癥[35]，提高母豬腸道有益菌比例[36]，抑制促炎因子TNF-α、IL-1β等的釋放，有效抑制機體炎癥持續發生[37]。DE NARDI等[24]研究發現植物多酚和精油混合物通過顯著降低高谷物飼糧條件下母牛血清淀粉樣蛋白A和LPS結合蛋白水平，緩解機體炎癥反應，但對血清IL-6含量無顯著影響。本試驗中，添加20和40 mg·kg-1BW的GSPs顯著提高了瘤胃組織和血清抗氧化酶活性，降低了MDA含量，同時降低了血清炎癥因子TNF-α和IL-10的水平，對瘤胃組織也有類似的作用趨勢，說明添加適量 GSPs后羔羊機體抗氧化能力有所提高，對高精料所致的瘤胃及全身炎癥也有緩解的潛力。

4 結論

高精料飼糧條件下，飼喂適量葡萄籽原花青素可以提高羔羊瘤胃 pH，提高血清和瘤胃組織抗氧化能力，降低血清促炎因子水平，提高羔羊采食量和日增重，對羔羊健康具有潛在的保護效應。在本試驗條件下，葡萄籽原花青素的最佳飼喂量為20 mg·kg-1BW。