高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)方硫酸新霉素滴眼液中3種成分含量

趙 猛，李 玲

（江蘇省連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 連云港 222000）

復(fù)方硫酸新霉素滴眼液的主要適應(yīng)證為急、慢性結(jié)膜炎、角膜炎、鞏膜炎、葡萄膜炎、急性鞏膜炎、白內(nèi)障、青光眼、角膜移植術(shù)后，以及眼部機(jī)械性損傷或化學(xué)燒傷處理等，主成分包括硫酸新霉素、地塞米松磷酸鈉、肌苷等，處方中還加入了抑菌劑，以延長(zhǎng)藥品保質(zhì)期。其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定僅以硫酸新霉素和地塞米松磷酸鈉為指標(biāo)成分，且后者的測(cè)定方法為異煙肼比色法［1］，操作較煩瑣，雜質(zhì)干擾大；而對(duì)于抑菌劑類成分含量的控制，標(biāo)準(zhǔn)中也未涉及。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定復(fù)方硫酸新霉素滴眼液中肌苷、羥苯乙酯和地塞米松磷酸鈉3種成分的含量［2-5］。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀，包括Waters 2998 PDA檢測(cè)器和Empower色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；BP211D型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司，精度為十萬分之一）；KH-700DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率為700W，頻率為40kHz）。

1.2 試藥

復(fù)方硫酸新霉素滴眼液（武漢五景藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為18080106，18120104，19040113）；肌苷對(duì)照品（批號(hào)為140669-201606，含量為98.6%），羥苯乙酯對(duì)照品（批號(hào)為100847-201604，含量為99.9%），地塞米松磷酸酯對(duì)照品（批號(hào)為101116-201803，含量為99.1%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，磷酸、三乙胺為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex GeminiC18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：1%三乙胺溶液［用磷酸調(diào)pH至（3.0±0.05），A］-甲醇（B），梯度洗脫（0～6 min時(shí)80%A，6～8 min時(shí)80%A→50%A，8～30 min時(shí)50%A）；流速：1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：248 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：50μL。

2.2 溶液制備

取肌苷、羥苯乙酯和地塞米松磷酸酯對(duì)照品各適量，精密稱定，置同一容量瓶中，加流動(dòng)相制成質(zhì)量濃度分別為1 009.7，417.4，1 004.4μg／mL的混合對(duì)照品貯備溶液（地塞米松磷酸酯質(zhì)量折算為地塞米松磷酸鈉質(zhì)量）；精密移取1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。精密量取樣品1 mL，置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，即得供試品溶液。按復(fù)方硫酸新霉素滴眼液處方和工藝制備缺肌苷、羥苯乙酯和地塞米松磷酸鈉的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液色譜中，在與肌苷、羥苯乙酯和地塞米松磷酸酯對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處無干擾峰，表明方法專屬性良好。

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，置20 mL容量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，制成系列混合對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各50μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以肌苷、羥苯乙酯和地塞米松磷酸鈉進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y1＝1.313 6×105X1-5.926 7×104（r1＝0.999 7），Y2＝2.277 8×105X2-7.274 6×104（r2＝0.999 5），Y3＝7.160 3×104X3-7.971 5×104（r3＝0.999 5）。結(jié)果表明，肌苷、羥苯乙酯和地塞米松磷酸 鈉 進(jìn) 樣 量 在2.525～7.575μg、1.055～3.160μg、2.510～7.535μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果肌苷、羥苯乙酯和地塞米松磷酸鈉峰面積的RSD分別為0.29%，0.33%，0.44%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果肌苷、羥苯乙酯和地塞米松磷酸鈉峰面積的RSD分別為0.57%，0.46%，0.42%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取樣品（批號(hào)為18080106）1mL，各6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果肌苷、羥苯乙酯和地塞米松磷酸鈉平均含量分別為937，283，982μg／mL，RSD分別為0.68%，0.94%，0.51%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n＝6）

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為18080106）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積，計(jì)算樣品含量，并與原標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)得的地塞米松磷酸鈉含量進(jìn)行比較。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（μg／mL，n＝3）Tab.2 Content determination of three constituents in the samples（μg／mL，n＝3）

3 討論

預(yù)試驗(yàn)中，參考文獻(xiàn)［6-8］，分別考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-1%三乙胺溶液為流動(dòng)相時(shí)等度洗脫和梯度洗脫對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，采用甲醇-1%三乙胺溶液梯度洗脫體系，基線平穩(wěn)，各峰出峰時(shí)間適宜，且分離度較好，因此最終選擇甲醇-1%三乙胺溶液作為流動(dòng)相，并優(yōu)化梯度洗脫程序。同時(shí)，考察了檢測(cè)波長(zhǎng)分別為240，243，248，253 nm時(shí)的色譜圖，結(jié)果以248 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，各峰吸收強(qiáng)度適宜，分離度好。

眼用制劑中的抑菌劑是導(dǎo)致眼部不良反應(yīng)的重要因素［9-10］，長(zhǎng)期使用該類眼用制劑可能損害眼部健康，因此控制眼用制劑中抑菌劑的含量對(duì)于減少用藥風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。本研究中采用HPLC法對(duì)地塞米松磷酸鈉含量進(jìn)行測(cè)定，與原標(biāo)準(zhǔn)中異煙肼比色法測(cè)定的地塞米松磷酸鈉含量相比，結(jié)果準(zhǔn)確度相當(dāng)，且增加了對(duì)肌苷和抑菌劑羥苯乙酯的含量測(cè)定，方法簡(jiǎn)便，其他組分干擾小，精密度、重復(fù)性、回收率均良好，可用于復(fù)方硫酸新霉素滴眼液的質(zhì)量控制。