柴胡安心膠囊揮發(fā)性成分氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜指紋圖譜研究*

于 靜，陳 威，張彥景，楊繼章，孫國(guó)祥，王玲嬌△

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050031； 2.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北 石家莊 050017；3.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016）

柴胡安心膠囊是醫(yī)院院內(nèi)制劑，有疏肝理氣、鎮(zhèn)靜安神功效，主要組方藥材（如柴胡、白芍、桂枝等）富含揮發(fā)性成分，其中柴胡的揮發(fā)性成分有解熱鎮(zhèn)痛、保護(hù)心血管作用［1］；白芍的揮發(fā)性成分如丹皮酚可改善腦缺血再灌注，有抗抑郁、抗焦慮作用［2］；桂枝中肉桂醛的鎮(zhèn)靜、降壓作用顯著［3］。該制劑處方組成中含揮發(fā)性成分的藥味超總量的60%，在制劑加工過程中，濃縮液表面可見含香氣的油類物質(zhì)層，目前對(duì)柴胡安心膠囊的研究主要集中于極性部位［4-5］，尚未見對(duì)該制劑揮發(fā)性成分的詳細(xì)研究。數(shù)字化指紋圖譜是以數(shù)學(xué)原理對(duì)指紋圖譜的特征進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘的數(shù)字加工過程［6］，以多數(shù)據(jù)體現(xiàn)指紋圖譜特征，能全面且整體地反映中藥化學(xué)成分的內(nèi)在質(zhì)量。本研究中采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS）法測(cè)定柴胡安心膠囊中揮發(fā)性成分，并建立指紋圖譜，為闡明其抗焦慮、抗抑郁作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和基于揮發(fā)性成分的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TRACE DSQ型氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Sartorius BS110S型分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

柴胡安心膠囊（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，批號(hào)分別為170813，170826，170901，170914，170928，170834，170841，170855，170935，170959，170968，規(guī)格為每粒0.5 g）；試驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為純化水。柴胡（批號(hào)為180601CP254）、白芍（批號(hào)為180601CP072）、龍骨（批號(hào)為20180101）、夏枯草（批號(hào)為20180401）、延胡索（批號(hào)為20160901）、炙甘草（批號(hào)為20180101），均購(gòu)自河北新祁有限公司；葛根（批號(hào)為18031901）、清半夏（批號(hào)為18070701）、珍珠母（批號(hào)為18011501）、干姜（批號(hào)為18011601），均購(gòu)自國(guó)藥樂仁堂有限公司；桂枝（批號(hào)為180601CP252）、茯苓（批號(hào)為180601CP212）、牡蠣（批號(hào)為180501CP154）、大棗（批號(hào)為171201CP611），均購(gòu)自河北萬(wàn)修藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

氣相色譜條件：色譜柱為DB-5ms毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；載 氣 為 高 純 度 氦（純 度≥99.999%）；流速為1.0 mL／min；進(jìn)樣口溫度為250℃；進(jìn)樣量為1μL；程序升溫，起始溫度60℃、保持4 min，以5℃／min的速率升至170℃、保持4 min，以5.0℃／min的速率升至280℃，保持10 min；分流比為20∶1（分流進(jìn)樣）。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊離子源，轟擊能量為70 eV；離子源溫度為230℃；傳輸線溫度為250℃；溶劑延遲時(shí)間為4 min；質(zhì)荷比（m／z）為55～550。

2.2 供試品溶液制備

取樣品內(nèi)容物約5 g，精密稱定，加入50 mL正己烷，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）處理20 min（2次），濾過，合并濾液，濃縮后用正己烷定容至10 mL，上清液4 000 r／min離心10 min，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取供試品溶液（批號(hào)為170813）適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定6次，以12號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于0.96%，相對(duì)峰面積的RSD小于2.26%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液（批號(hào)為170813）適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12，16，24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，以12號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于0.87%（n＝8），相對(duì)峰面積的RSD小于2.26%（n＝8），表明室溫下供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取藥材樣品（批號(hào)為170813）適量，各6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，以12號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于0.91%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD小于2.91%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4 GC-MS指紋圖譜的建立及共有峰的指認(rèn)

指紋圖譜建立：取12批樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，以其中峰面積最大的12號(hào)峰為參照峰，確定53個(gè)共有峰，將結(jié)果導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評(píng)價(jià)系統(tǒng)3.0軟件［7］，以平均值法計(jì)算生成對(duì)照指紋圖譜，詳見圖1。對(duì)12批樣品及對(duì)照指紋圖譜的GC-MS圖進(jìn)行擬合，得到GC-MS疊加指紋圖譜，詳見圖2。

圖1 柴胡安心膠囊氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)照指紋圖譜Fig.1 GC-MS reference fingerprint of Chaihu Anxin Capsules

圖2 12批柴胡安心膠囊氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜疊加指紋圖譜Fig.2 GC-MS superimposed fingerprint of 12 batches of Chaihu Anxin Capsules

整體評(píng)價(jià)柴胡安心膠囊質(zhì)量：采用系統(tǒng)指紋定量法［8］，從中藥的整體宏觀定性角度和整體定量角度對(duì)其進(jìn)行量化控制。宏定性相似度（Sm）為雙定性相似度（SF和SF′）均值，計(jì)算公式見式（1）；宏定量相似度（Pm）為雙定量相似度（C和P）均值，計(jì)算公式見式（2）；α為指紋均化性變動(dòng)誤差控制系數(shù)，計(jì)算公式見式（3），據(jù)此將中藥質(zhì)量劃分為8級(jí)，詳見表1［9］。質(zhì)量級(jí)別由Sm，Pm，α中級(jí)別最低參數(shù)決定，3個(gè)公式中，n為指紋峰數(shù)，xi與yi為各指紋峰的積分面積，γ為指紋信號(hào)均化系數(shù)。

表1 系統(tǒng)指紋定量法判定依據(jù)Tab.1 The evaluation basis of system fingerprint quantitative method

將GC-MS指紋圖譜看作一個(gè)系統(tǒng)，用Sm表示指紋的數(shù)量和分布比例；用Pm監(jiān)測(cè)指紋的整體含量；用α限定指紋變異范圍。以對(duì)照指紋圖譜為標(biāo)準(zhǔn)得12批樣品的Sm，Pm，α值（見表2）。結(jié)果顯示，除S1和S2外，其余10批柴胡安心膠囊的Sm均大于0.90，表明各個(gè)批次制劑中成分?jǐn)?shù)量和分布比例十分相似，除S2外，其余批次樣品的Pm均大于90，且不同批次樣品含量有差異。根據(jù)系統(tǒng)指紋定量法可知，樣品質(zhì)量極好、很好、中等的分別有5批、5批、2批。

共有峰歸屬和指認(rèn)：對(duì)12批樣品的GC-MS指紋圖譜根據(jù)共有峰的保留時(shí)間，結(jié)合美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)局（NIST）譜庫(kù)檢索及文獻(xiàn)檢索［10-15］，并進(jìn)行對(duì)比，共標(biāo)定53個(gè)共有峰，其中44個(gè)峰占峰面積的99.57%，故對(duì)這44個(gè)峰進(jìn)行鑒定。鑒定出了44種化學(xué)成分并確定了歸屬，其中主要包括糠醛（22.50%）、丹皮酚（15.80%）、棕櫚酸（12.33%）、桉葉油醇（4.48%）等，詳見表3。結(jié)果表明，揮發(fā)性成分多數(shù)出自柴胡、葛根、白芍、延胡索、夏枯草、半夏、桂枝藥材（占峰面積的97.15%），上述藥材在組方中的配比超過65%，進(jìn)一步證實(shí)了揮發(fā)性成分可能在柴胡安心膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)中發(fā)揮了積極作用。

3 討論

本試驗(yàn)中采用GC-MS法對(duì)柴胡安心膠囊揮發(fā)性成分進(jìn)行指紋圖譜研究，為了更好地反映其揮發(fā)性成分，供試品溶液制備過程中，比較了回流法、超聲法、揮發(fā)油法的提取率。結(jié)果表明，后兩者優(yōu)于前者，從圖譜結(jié)果觀察后兩者結(jié)果差異不大，以操作簡(jiǎn)便考量，選擇超聲法作為提取方法。并考察了石油醚、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈等溶劑對(duì)提取結(jié)果的影響，結(jié)果表明，以正己烷為溶劑時(shí)提取最完全，色譜圖的峰數(shù)最多，干擾成分最少，基線最平，故以正己烷作為提取溶劑。

本試驗(yàn)采用“中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評(píng)價(jià)系統(tǒng)3.0”軟件，以平均值法計(jì)算生成對(duì)照指紋圖譜，對(duì)12批樣品及對(duì)照指紋圖譜的GC-MS圖進(jìn)行擬合，得GC-MS疊加指紋圖譜，按系統(tǒng)指紋定量法鑒別出12批樣品的不同質(zhì)量等級(jí)。該法與國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A版）”相比，前者以?shī)A角余弦法與相關(guān)系數(shù)法計(jì)算相似度受大指紋峰影響嚴(yán)重，不僅掩蓋了小峰貢獻(xiàn)，且不能定量評(píng)價(jià)，對(duì)于小峰突出且有可能為活性成分的指紋圖譜鑒定質(zhì)量可能導(dǎo)致誤判。本研究中采用的系統(tǒng)指紋定量法，將中藥的指紋整體看作一個(gè)系統(tǒng)，應(yīng)用Sm，Pm，α對(duì)中藥指紋量和分布比例、含量、比例變異范圍進(jìn)行了整體監(jiān)測(cè)，三者結(jié)合來控制中藥質(zhì)量，克服了傳統(tǒng)的中藥指紋圖譜技術(shù)的小峰模糊化的缺點(diǎn)。

GC-MS法可用于鑒別藥物的真?zhèn)魏团袛嘀兴幉募爸苿┵|(zhì)量的穩(wěn)定性［16］。相較于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，GC-MS法重復(fù)性好，化合物裂解圖譜再現(xiàn)性高，具有商品化的譜庫(kù)可供檢索，在缺乏對(duì)照品的情況下依然是化合物定性分析的有效方法［17］。本試驗(yàn)中采用NIST譜庫(kù)對(duì)小分子揮發(fā)性成分進(jìn)行指認(rèn)，其譜圖結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

表2 12批柴胡安心膠囊質(zhì)量判定結(jié)果Tab.2 Quality evaluation results of 12 batches of Chaihu Anxin Capsules

表3 柴胡安心膠囊GC-MS指紋圖譜中44個(gè)共有峰指認(rèn)結(jié)果Tab.3 Identification of 44 common peaks in GC-MS fingerprint of Chaihu Anxin Capsules

由藥味歸屬及共有峰指認(rèn)結(jié)果可知，柴胡安心膠囊的指紋圖譜主要反映了柴胡、夏枯草、白芍、延胡索、桂枝這5種藥味的成分，且大都為活性成分。如柴胡中的棕櫚酸可增強(qiáng)免疫力、保護(hù)心血管，白芍中的丹皮酚可抗抑郁、抗焦慮，亞油酸可調(diào)血脂、軟化血管，夏枯草中糠醛可抗炎、調(diào)節(jié)免疫，桂枝中肉桂醛可鎮(zhèn)靜、降壓等。通過在指紋圖譜中控制上述成分，可有效評(píng)價(jià)該制劑的整體質(zhì)量。

綜上所述，所建立的GC-MS指紋圖譜法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、可靠，可用于柴胡安心膠囊揮發(fā)性成分的研究及整體質(zhì)量控制，也為后續(xù)藥效學(xué)的研究提供了參考。