注射用前列地爾干乳劑中甲氧基苯胺值測(cè)定方法的建立*

李 瀟，郭 雷，游 暢，白亦昊，邵天舒，張建敏，王 靜，郜昭慧，丁 銳，周長(zhǎng)明

（北京市藥品檢驗(yàn)所·國(guó)家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

難溶性藥物多具有親脂性，將其溶于適宜的油相中制成載藥乳，可有效提高其溶解度［1］。靜脈注射用乳劑常被用作藥物載體［2］，但易氧化降解、穩(wěn)定性差，凍干技術(shù)應(yīng)用于載藥微乳制劑，有利于制劑的穩(wěn)定［3］。脂肪乳中的油相在制備過(guò)程中極易分解為醛、酮、酸等，易引起臨床用藥的安全隱患［1］。前列地爾臨床多被用于改善心腦血管微循環(huán)障礙，以及臟器移植術(shù)后的抗栓治療等［4］。注射用前列地爾干乳劑為前列地爾無(wú)菌凍干乳劑，使用時(shí)加水溶解后為白色或類(lèi)白色乳液，其輔料為大豆油及甘油。預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，以三氟乙酸為破乳劑可使油相更好地釋放，有助于甲氧基苯胺值的測(cè)定。本研究中建立了專(zhuān)屬性和耐用性均良好的測(cè)定注射用前列地爾干乳劑中甲氧基苯胺值的方法［5-6］。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）；Rotavapor R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；MEGAFUGE8型低速離心機(jī)（美國(guó)ThermoScientific公司）；KQ-500型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

注射用前列地爾干乳劑（A企業(yè)，批號(hào)分別為13102864，13102525，14100265，13102843，14012040，15010091）；4-甲氧基苯胺（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)為＃BVBW9024，含量為99%）；其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

避光操作，取樣品5瓶（規(guī)格為10μg）或10瓶（規(guī)格為5μg）內(nèi)容物，置25 mL容量瓶中，加水5 mL使復(fù)乳，加入三氟乙酸2 mL，振搖約1 min使破乳，用異辛烷定容，振搖提取約1 min，2 000 r／min離心5 min；取異辛烷層置圓底燒瓶中，并置60℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)15 min，將殘?jiān)卯惐?異辛烷（2∶8，V／V）適量溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用異丙醇-異辛烷（2∶8，V／V）定容，搖勻，即得供試品溶液。按注射用前列地爾處方，制備缺油相的空白對(duì)照溶液。取4-甲氧基苯胺125 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL棕色容量瓶中，用冰醋酸超聲（功率500 W，頻率40 kHz）溶解，并定容，即得0.25%4-甲氧基苯胺冰醋酸溶液，遮光放置，臨用現(xiàn)配。

2.2 測(cè)定方法

精密量取異丙醇-異辛烷（2∶8，V／V）與供試品溶液各5 mL，分別置甲、乙2支具塞試管中，分別精密加入0.25%4-甲氧基苯胺冰醋酸溶液1 mL，密塞，搖勻，避光準(zhǔn)確放置10 min，以異丙醇-異辛烷（2∶8，V／V）為空白，在350 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度A1和A2；另取供試品溶液，以異丙醇-異辛烷（2∶8，V／V）為空白，在350 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A0。按下列公式計(jì)算得本品的甲氧基苯胺值擬定限度為5.0。

甲氧基苯胺值＝25×［1.2×（A2-A1）-A0］／W

式中，A1為空白溶劑反應(yīng)后的吸光度；A2為供試品溶液反應(yīng)后的吸光度；A0為供試品溶液未反應(yīng)的吸光度；1.2為加入4-甲氧基苯胺冰醋酸溶液后的溶液稀釋因子；W為供試品溶液中的油相質(zhì)量（g），結(jié)合本品處方折算后以0.75計(jì)。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取空白對(duì)照溶液5 mL，置25 mL容量瓶中，按2.2項(xiàng)下“加入2 mL三氟乙酸……”起，同法操作，并計(jì)算甲氧基苯胺值。不含油相的處方組分混合后測(cè)定的甲氧基苯胺值為0.003 3，遠(yuǎn)低于國(guó)家藥典委員會(huì)公示的脂肪乳相關(guān)品種標(biāo)準(zhǔn)中甲氧基苯胺值的限度［7-9］，表明方法專(zhuān)屬性良好。

2.4 線性關(guān)系與檢測(cè)限考察

取供試品5，15，25，35，45，50，60μg，分別置25 mL容量瓶中，同2.1項(xiàng)下方法制成系列供試品溶液。按2.2項(xiàng)下“加入2 mL三氟乙酸……”起，同法操作，以甲氧基苯胺值（A）為縱坐標(biāo)、供試品中油相的量（W）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，待測(cè)溶液質(zhì)量濃度在0.2～2.4μg／mL范圍內(nèi)的線性回歸方程為A＝0.556 2W＋0.048 5（r2＝0.963 7，n＝7），在0.6～2.4μg／mL范圍內(nèi)的線性回歸方程為A＝0.6361W-0.0058（r2＝0.9902，n＝7），表明甲氧基苯胺質(zhì)量濃度在0.6～2.4μg／mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好；在0.2μg／mL時(shí)偏離線性，但仍可檢出。總的來(lái)看，檢測(cè)限約為0.2μg／mL，靈敏度良好。詳見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系及檢測(cè)限考察結(jié)果Tab.1 Linear relationship and results of LOD

2.5 耐用性試驗(yàn)

稱(chēng)取樣品適量，精密稱(chēng)定，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2項(xiàng)下試驗(yàn)條件［分別設(shè)置旋蒸溫度和時(shí)間為55℃10min、55℃20min、65℃10min、65℃20min］進(jìn)樣測(cè)定，記錄吸光度，并計(jì)算甲氧基苯胺值。結(jié)果見(jiàn)表2。可見(jiàn)，旋蒸溫度和時(shí)間發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿(mǎn)足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

2.6 樣品中甲氧基苯胺值測(cè)定

取6批樣品各適量，分別按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2項(xiàng)下方法測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄吸光度，并計(jì)算甲氧基苯胺值。結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of the durability test

表3 樣品中甲氧基苯胺值測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab.3 Content determination of anisidine value in Alprostadil Dried Emulsion for Injection（n＝3）

3 討論

甲氧基苯胺值常被用于評(píng)價(jià)油脂中的次級(jí)氧化產(chǎn)物水平，是脂肪乳質(zhì)量控制的重要指標(biāo)［10］。現(xiàn)行版英國(guó)藥典及美國(guó)藥典中，均收錄了甲氧基苯胺值的測(cè)定方法：取供試品，用異辛烷溶解后，與4-甲氧基苯胺發(fā)生反應(yīng)，并在350 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算，即得。此外，由于4-甲氧基苯胺的光敏性，因此均要求避光操作［11-12］。

脂肪乳是將脂質(zhì)以小液滴狀分散在水中形成的非均相的水包油型乳劑。市售脂肪乳主要是靜脈注射類(lèi)，其中脂質(zhì)成分主要是大豆油［13］。脂肪乳能明顯提高疏水藥物在水溶液中的溶解度，從而增加藥物的生物利用度［14］。注射用前列地爾干乳劑主要含有甘油和大豆油。目前，國(guó)家藥典委員會(huì)公示的脂肪乳相關(guān)品種標(biāo)準(zhǔn)中，甲氧基苯胺值的限度標(biāo)準(zhǔn)有3.0及5.0［7-9］。本研究中樣品的油相質(zhì)量均遠(yuǎn)小于其他乳劑產(chǎn)品，參考上述標(biāo)準(zhǔn)，將本品的甲氧基苯胺值限度定為不得過(guò)5.0。在該限度下，患者接觸到的醛、酮類(lèi)等有害物質(zhì)的量仍遠(yuǎn)小于其他乳劑產(chǎn)品，可以保證本品具有良好的安全性。國(guó)家藥典委員會(huì)于2015年6月15日公示的《丙泊酚乳狀注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（征求意見(jiàn)稿）》中，將供試品溶于無(wú)水乙醇后，反復(fù)旋蒸除盡水分，再用異丙醇-異辛烷（2∶8，V／V）溶解后進(jìn)行測(cè)定。此方法需要對(duì)無(wú)水乙醇反復(fù)旋蒸，以除盡水分，比較麻煩。本研究中參考相關(guān)文獻(xiàn)，并結(jié)合本品的劑型特點(diǎn)，建立了適于本品中甲氧基苯胺值的檢測(cè)方法。高速離心、高壓電場(chǎng)或添加破乳劑均可使乳液失穩(wěn)［15］，且高速離心或高壓電場(chǎng)對(duì)設(shè)備也有一定要求，因此本研究中選擇了相對(duì)簡(jiǎn)單的方法，即加破乳劑。醛、酮類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生于油相中，而本品為水包油型乳劑，因此加入三氟乙酸后，乳狀液被破壞，達(dá)到了油、水兩相分離，從而可更好地從油相中提取醛、酮類(lèi)物質(zhì)，以進(jìn)行檢測(cè)。

綜上所述，本研究中所建立的方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于注射用前列地爾干乳劑中甲氧基苯胺值的測(cè)定。