Box-Behnken響應面法優(yōu)選山蠟梅葉總香豆素提取工藝*

徐焱丹，金賢武，毛坤軍

（1.江西省上饒市第三人民醫(yī)院，江西 上饒 334000； 2.江西省上饒市食品藥品檢驗檢測中心，江西 上饒 334000； 3.江西醫(yī)學高等專科學校，江西 上饒 334000）

山蠟梅葉為蠟梅科蠟梅屬植物山蠟梅Chimonanthus nitens Oliv.的干燥葉，生于山地疏林中或石灰?guī)r山地，主產(chǎn)于安徽、浙江、江西等地，是江西的道地藥材［1］。其味辛、微苦，性涼，有清熱解毒、祛風解表之功效，臨床常用于治療中暑、咳嗽痰喘、胸悶、蟻叮咬等，民間常用山蠟梅葉泡茶以防治感冒［2］。化學成分研究表明，山蠟梅葉主要含香豆素、黃酮及生物堿等成分［3-5］。本研究中以山蠟梅葉總香豆素得率為評價指標，采用單因素試驗和響應面法優(yōu)選其總香豆素的提取工藝。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-2600型紫外分光光度計（日本Shimadzu公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；FA2004B型電子天平（萬分之一，上海佑科儀器儀表公司）。

1.2 試藥

6，7-二甲氧基香豆素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111740-200702，含量為99.30%）；山蠟梅葉（江西佑美制藥有限公司，批號為20170905）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總香豆素含量測定

溶液制備：稱取6，7-二甲氧基香豆素對照品5.0 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.2 mg／mL的對照品溶液。取藥材樣品粉末5.0 g，精密稱定，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）提取50 min，取提取液1 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得供試品溶液。

檢測波長設定：取對照品溶液適量，進行全波長掃描。結(jié)果對照品溶液在340 nm波長處有明顯吸收。

圖1 單因素試驗結(jié)果Fig.1 Results of the single factor test

線性關系考察：分別精密吸取6，7-二甲氧基香豆素對照品溶液1，2，4，6，8，10 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容。以甲醇為空白對照，在340 nm波長處測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標、6，7-二甲氧基香豆素對照品質(zhì)量濃度（C）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程A＝0.126C＋0.072（r＝0.999 7，n＝6）。結(jié)果表明，6，7-二甲氧基香豆素質(zhì)量濃度在0.002～0.020 mg／mL范圍內(nèi)與吸光度線性關系良好。

樣品含量測定：取藥材樣品，同法制備供試品溶液，以甲醇為空白對照，在340 nm波長處測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算總香豆素含量，并計算提取率。

2.2 單因素試驗

超聲功率：取藥材樣品粉末，精密稱定，每份5.0 g，共3份，在不同超聲功率下，以60%乙醇、液料比20∶1，超聲提取45 min，同2.1項下方法測定總香豆素含量，并計算提取率。結(jié)果表明，超聲功率為200 W時最佳。結(jié)果見圖1 A。

超聲時間：取藥材樣品粉末，精密稱定，每份5.0 g，共3份，以60%乙醇、液料比20∶1，超聲功率200 W，取不同超聲提取時間，按2.1項下方法測定含量并計算提取率。結(jié)果見圖1 B，表明超聲提取為45 min時最佳。

乙醇體積分數(shù)：取藥材樣品粉末，精密稱定，每份5.0 g，共3份，在不同乙醇體積分數(shù)下，以液料比20∶1，超聲功率200 W，超聲提取45 min，按2.1項下方法測定含量并計算提取率。結(jié)果見圖1 C，表明乙醇體積分數(shù)為60%時最佳。

液料比：取藥材樣品粉末，精密稱定，每份5.0 g，共3份，在不同液料比下，以60%乙醇、超聲功率200 W，提取45 min，同2.1項下方法測定含量并計算提取率。結(jié)果見圖1 D，表明液料比為20∶1時最佳。

2.3 提取工藝優(yōu)化

響應面試驗：根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以超聲功率（A）、超聲時間（B）、乙醇體積分數(shù)（C）、液料比（D）為4個因素，以總香豆素得率為評價指標，采用4因素3水平的Box-Behnken響應面法進行試驗設計，因素與水平見表1，響應面試驗設計與結(jié)果見表2。

響應面分析：采用Design-Expert 8.0軟件對表2中數(shù)據(jù)進行擬合分析，得總香豆素得率對因素A，B，C，D的回歸方程，Y＝0.90＋0.074A＋0.046B＋0.077C＋0.045D＋0.001AB-0.042AC-0.075AD-0.020BC-0.028 BD-0.057 CD-0.067 A2-0.085 B2-0.12 C2-0.046D2。選用的模型有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；失擬項無統(tǒng)計學意義（P＝0.1735＞0.05）；模型的R2＝0.8009，RAdj2＝0.601 8，模型擬合度良好。結(jié)果顯示，超聲功率（A）和乙醇體積分數(shù)（C）對總香豆素得率有顯著影響（P＜0.05）；二次項B2、C2有顯著影響（P＜0.05），詳見表3。交互作用對山蠟梅葉總香豆素得率的影響見圖2。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and levels

表2 響應面試驗設計與結(jié)果Tab.2 Design and results of the response surface methodology

2.4 驗證試驗

采用Desige-Expert 8.0軟件對上述結(jié)果進行分析，得最佳超聲提取工藝為超聲功率233.47W，超聲時間49.96 min，乙醇體積分數(shù)62.50%，液料比18.44∶1，總香豆素得率為0.933%。結(jié)合實際操作的可行性，將條件修正為超聲功率230 W，超聲時間50 min，乙醇體積分數(shù)62%，液料比18∶1，進行驗證試驗，結(jié)果總香豆素得率為0.916%，與預測值的相對偏差為1.31%，與理論預測值基本一致。

3 討論

香豆素類成分廣泛分布于中藥植物中，是很多中藥的主要活性成分。影響香豆素類成分提取的主要因素是提取時間、乙醇體積分數(shù)、液料比及提取溫度。因此，本試驗中選擇這4個因素為考察因素［6-8］。得最佳提取工藝為，超聲功率230 W，提取50 min，乙醇體積分數(shù)62%，液料比18∶1，驗證試驗結(jié)果表明，在此條件下總香豆素得率與理論預測值基本一致。

表3 模型各項方差分析結(jié)果Tab.3 The ANOVA results of model items

圖2 不同因素交互作用對山蠟梅葉總香豆素提取率影響的等高線圖和響應面圖Fig.2 Contour plot and response surface plot of the interaction effects of various factors on the extraction rate of total coumarines from Chimonanthus nitens leaves

山蠟梅葉中主要含有黃酮、香豆素類成分，其中香豆素類具有抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗菌及松弛平滑肌、抗凝血等藥理作用［9-12］，該成分也是評價山蠟梅葉藥材質(zhì)量的重要依據(jù)。因此，本試驗中選擇香豆素類成分總香豆素的得率為評價指標。

綜上所述，優(yōu)選的提取工藝操作簡便、穩(wěn)定可行，可用于山蠟梅葉總香豆素的提取。