液相色譜–串聯質譜法測定谷類食品中5種合成著色劑

張春娥，廖若宇，孫 悅，劉新保，田建文

（1.寧夏回族自治區糧油產品質量檢測中心，寧夏 銀川 750001；2.寧夏農林科學院，寧夏 銀川 750001）

目前，在食品安全風險監測任務中，存在樣品種類多，檢測項目多樣化而標準適用范圍單一的問題，標準不適用于規定檢測任務的現象，可能會存在含有違禁成分或是添加劑超出 GB2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》規定的最大使用限量標準要求而檢不出的隱患。現行有效的合成著色劑測定標準有 4個：GB5009.35—2016《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》、SN/T4457—2016《出口飲料、冰淇淋等食品中 11種合成著色劑的檢測 液相色譜法》、DBS52/023—2017《食品安全地方標準 食品中13種水溶性合成著色劑的測定》、GB/T21916—2008《水果罐頭中合成著色劑的測定 高效液相色譜法》。GB5009.35—2016標準范圍適用于飲料、配制酒、硬糖、蜜餞、淀粉軟糖、巧克力豆及著色糖衣制品中合成著色劑的測定，由于谷類食品中淀粉吸附色素的特性，該標準不適用于玉米渣、玉米片、黑米、掛面等制品中合成著色劑的測定。SN/T4457—2016適用于果汁、碳酸飲料、冰淇淋中 11種合成著色劑的測定，DBS52/023—2017規定了饅頭、面條中13種合成著色劑的測定，GB/T21916—2008規定了水果罐頭中8種合成著色劑的測定。這四個標準范圍均不包含風險監測任務中的樣品種類，并且按照標準中的提取方法提取的樣品在凈化環節會有損失，導致測定結果偏低，加標回收率低不滿足 GB/T27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》質控要求。

食用小蘇打，有效成分為碳酸氫鈉，主要用于食品、飲料汽水和冷飲中二氧化碳的發生劑，還用作洗滌劑，由于碳酸氫鈉有較高的解吸能力，可用作溶出劑[1]。碳酸氫鈉在食品工業中的研究也有報道，例如，用植物汁液和碳酸氫鈉腌漬可以提高乳山羊肉的燒烤品質[2]；同時，碳酸氫鈉還可以應用于天然色素的提取工藝中，有研究表明，茶葉在30 ℃條件下浸提30 min，碳酸氫鈉用量為10 g/L條件下，可以有效提取茶葉中的茶色素[3]。

日落黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅和亮藍，均為水溶性偶氮類著色劑，易溶于水，溶于甘油及丙二醇，不溶于油脂，都具有耐酸性[4]。目前國內外研究色素的樣品種類多，既有天然色素提取與測定的研究，也有合成著色劑的測定研究。如不同葡萄品種中花青素和酚類化合物的提取[5]，酸奶中合成著色劑的提取[6]，火鍋調味品中胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、日落黃等水溶性色素和其他脂溶性色素的測定[7]，軟飲料、糕點和方便面中梔子黃的測定[8]，魚制品中日落黃、莧菜紅和誘惑紅等著色劑的測定[9]。色素的測定方法主要有液相色譜法[10]、液相–電噴霧質譜法[11]、RamTracer-200-HS拉曼光譜儀分析法[12]、紫外可見分光光度測定法[13]。有關合成著色劑的提取試劑主要為氨化甲醇溶液[14]、乙醇–乙腈–氨水[15-16]、氨化乙醇溶液[17]，這些提取試劑的共同點都是堿性條件，不足之處是氨水溶液味道刺激，有機試劑用量大。

為了簡化食品中合成著色劑提取工藝，提高加標回收率，本研究以大米粉、小米、玉米粉、發糕、玉米窩頭、蕎麥掛面、玉米片、玉米糝子為實驗樣品，采用堿性溶液體系提取離心后，陰離子交換柱進行凈化，25%氨水甲醇洗脫，制成水溶液，注入高效液相色譜質譜儀進行定量分析，完善谷類食物中合成著色劑檢測體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小米、發糕、玉米窩頭、蕎麥掛面、玉米片、玉米糝子、食用小蘇打：寧夏銀川超市或市場；分析檢測用質控樣品：廣州譜恩科學儀器有限公司；甲醇、乙腈（色譜級）：Fisher Scientific 公司；異丙醇、甲酸（色譜級）、氨水（分析純）、乙酸銨（優級純）：天津市光復精細化工研究所；吐溫20（化學純）、丙三醇、1,2-丙二醇（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；乙醇（分析純）：安徽安特食品股份有限公司；Strata X-AW SPE：美國Phenomenex公司；標準品日落黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅和亮藍（0.50 mg/mL）：中國計量科學研究院。

1.2 儀器設備

Agilent 1290 Infinity II液相色譜-6470三重四極桿質譜聯用儀，配有 ESI離子源：美國Agilent公司；HU401K-超聲波清洗器：天津恒奧；HMG-D24氮吹儀：北京華安麥科生物技術有限公司；GL-20G-C高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；RV 10 Control旋轉蒸發儀：德國IKA公司；QL-901旋渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Perten 3100實驗磨：瑞典波通儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品中色素的提取

采用錘式旋風磨將干燥后的樣品粉碎至細度為100目的粉末狀樣品。稱取樣品5.00 g于離心管中，添加1.00 g食用小蘇打作為輔助提取劑，加入 30 mL 40%的甲醇水溶液，渦旋混合提取5 min，提取完畢后在 4 000 r/min條件下離心5 min，收集上清液，重復提取3次，將收集的上清液合并混勻。

1.3.1.1 提取試劑優化 取六份玉米粉各5.0 g，按1:6的比例加入提取液，添加1.0 g小蘇打作為輔助提取試劑，分別以V（甘油）/V（乙醇）=5∶95、V（1,2丙二醇）/V（無水乙醇）=10∶90、V（25%氨水）/V（甲醇）=5∶95、V（甲醇）/V（氨水）/V（水）=80∶2∶18、V（氨水）/V（乙醇）=1∶99和V（甲醇）/V（氨水）=40∶60為提取試劑，提取后測定加標回收率。

1.3.1.2 小蘇打的添加量 取六份玉米粉各5.0 g，按 1∶6的比例加入提取液，分別添加小蘇打量為：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、5.0 g，提取后測定加標回收率。

1.3.1.3 pH值對凈化工藝的影響 A組：中性環境（pH值=7），即凈化柱活化后用水平衡，保持中性環境；B組：堿性環境（pH值=12），即凈化柱活化后用 2%氨水平衡；C組：酸性環境（pH值=2.6），即凈化柱活化后用 2%甲酸水平衡，保持酸性環境。

1.3.2 提取液的固相萃取柱凈化

先后加1 mL甲醇、1 mL水活化固相萃取柱Strata X-AW SPE，在加1 mL 2%甲酸水溶液平衡凈化柱，濾液均棄去；取1 mL樣品提取液加入凈化柱，棄去濾液；加入1 mL 2%甲酸水溶液淋洗固相萃取柱，棄去濾液，將小柱抽干。加1 mL 25%氨水甲醇溶液洗脫固相萃取柱，控制流速，確保洗脫液逐滴下落，收集洗脫液；將收集的洗脫液采用氮吹方式吹干；用1 mL的去離子水復溶，渦旋混合1 min，待樣品充分溶解，將樣品溶液過0.22 μm親水性針式過濾器，待上機分析。

1.3.3 HPLC-MS/MS分析條件

采用Agilent SB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），柱溫為 30 ℃，以乙腈（A）、0.01 mol/L乙酸銨水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～2 min，95%B→80%B；2～3min，80%B→50%B；3～6 min，50%B→60%B，6～6.1 min，60%B→95%B，保持4 min），流速 0.3 mL/min，進樣量為 5 μL。采用電噴霧（electrospray ionization，ESI）負離子模式，掃描方式為多反應檢測（multiple reaction monitoring，MRM），毛細管電壓3.5 kV，干燥器溫度350 ℃，干燥器流速8 L/min，鞘氣溫度250 ℃，鞘氣流速10 L/min，噴嘴電壓為1 500 V。測定5種合成著色劑的質譜參數見表1。

表1 5種合成著色劑的質譜參數Table 1 Mass spectrometry parameters of five dyes

1.3.4 標準曲線的制作

配制10 μg/mL的單一標準儲備液，4 ℃冰箱保存。日落黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅和亮藍分別取 10、20、40、60、80、100、120、140 μL于 2 mL樣品瓶，用去離子水定容配制成混標溶液，配制濃度分別為 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 μg/mL的系列梯度溶液，經 0.22 μm微孔濾膜過濾后進行色譜分析。

1.3.5 方法精密度

將600 ng/mL的5種合成著色劑標準混合溶液用方法1.3.3連續進樣6次，根據測定量計算其相對標準偏差（RSD）。

1.3.6 加標回收率

為了評價方法的準確度，進行了添加回收率實驗。選擇小米、玉米糝子、發糕、玉米窩頭、蕎麥掛面五種不同基質的食物樣品，加入日落黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅和亮藍5種待研究的合成著色劑，加標水平分別為1、2和10 μg/g，每個加標水平分別進行6個平行試驗。

1.4 數據處理方法

數據和圖表處理采用Excel軟件處理。

2 結果與分析

2.1 提取試劑的優化

針對谷類物質易吸附色素的特點，提取過程中，既要觀察所采用的試劑對色素的提取程度，又要考慮提取液的清澈程度。如圖1所示，采用V（甲醇）/V（氨水）=40∶60溶液連續提取合成著色劑，加標回收率在 80%～120%范圍，符合GB/T27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》標準對加標回收率的規定。因此，小蘇打添加在 V（甲醇）/V（氨水）=40∶60的提取試劑中可以充分提取合成著色劑。

圖1 采用不同的提取試劑對5種合成著色劑加標回收率的影響Fig.1 Effects of different extraction reagents on the recoveries of 5 synthetic colorants

2.2 小蘇打的添加量對提取率的影響

目標物在水相中的溶解度通常隨離子強度的增加而降低。有研究表明：NaCl、NaNO3、KCl和Na2CO3對可提高色素的萃取率，強度順序為：KCl＞NaCl＞NaNO3＞Na2CO3[13]。另一方面，隨著介質離子強度的增加，水溶液的粘度和密度也增加，導致傳質效率降低[18]。Rawikan Kachangoon[19]研究了 NaCl、Na2SO4、Na2CO3和 CH3COONa對水、土壤和尿液樣本中煙堿類殺蟲劑的萃取率影響，結果表明在峰面積上，加入Na2SO4可以提高萃取效率。為了研究離子強度對萃取方法的影響，優化小蘇打的添加量。結果表明：當小蘇打添加量增至2 g時，小蘇打會吸附亮藍。當小蘇打添加量增至5 g時，小蘇打會吸附一些紅色素。測試結果如圖2所示，當小蘇打的添加量為0 g時，5種合成著色劑的加標回收率均低于 60%，隨著小蘇打的添加量增大，加標回收率升高，而當小蘇打添加量為2.0 g和5.0 g時，部分色素加標回收率降低。考慮經濟效益及檢測結果的準確性，選取最優小蘇打添加量為1.0 g。因此，在合成著色劑的提取過程中加入食用小蘇打有助于合成著色劑分布于提取溶液中，但是加入過多的小蘇打導致樣品溶液粘度增加，使合成著色劑分子更難擴散到提取試劑溶液中。

圖2 小蘇打的添加量對5種合成著色劑回收率的影響Fig.2 Effect of the adding amount of sodium bicarbonate on recovery of 5 synthetic colorants

2.3 pH值對凈化工藝中樣品富集率的影響

Andrade等[20]采用Sep-pack C18分離純化軟飲料中的莧菜紅，也有聚酰胺、凝膠滲透色譜（GPC）、PWAX及Strata X-AW SPE等固相萃取柱的研究報道[21]。凈化工藝也會影響加標回收率，Strata X-AW是弱陰離子交換官能團化聚合物吸附劑，可完整保留pKa小于5的酸性化合物，本研究采用Strata X-AW固相萃取柱純化樣品，如圖3顯示，樣品提取液通過SPE后，A組液體含有顏色，固相萃取柱表面有淡淡的顏色；B組液體顏色明顯，固相萃取柱表面無顏色變化；C組液體無顏色，固相萃取柱表面明顯有顏色富集。測試結果如圖 3所示：在酸性環境中使用 Strata X-AW SPE凈化樣品，加標回收率高，與現有研究結果一致[15,17]。

圖3 pH對樣品合成著色劑回收率的影響Fig.3 Effect of pH on recovery of 5 synthetic colorants

2.4 小蘇打對合成著色劑的富集作用

采用添加有小蘇打的40%甲醇水溶液提取谷類食品中的著色劑，在酸性條件下通過固相萃取柱凈化，固相萃取柱表面有顯著的顏色富集，并且棄去的濾液無色。而未添加小蘇打的40%甲醇水溶液提取液通過固相萃取柱凈化時，棄去的濾液有明顯的顏色，根據加標回收率測試試驗結果顯示，在酸性環境中，含有小蘇打的合成色素提取液更容易被固相萃取柱中的吸附劑吸附。因此，小蘇打可使合成著色劑高效富集在固相萃取柱表面。

2.5 方法驗證

2.5.1 線性試驗結果

五種合成著色劑的線性范圍、相關系數、檢出限和回歸方程的研究結果見表2，5種合成著色劑在0.1～1.4 μg/mL質量濃度范圍線性關系良好，相關系數（R2）均高于0.990 0。檢出限在0.07～0.50 μg/g之間。

表2 合成著色劑的線性范圍、相關系數、檢出限和回歸方程Table 2 Linear range, coefficients of determination (R2), limits of detection and calibration equations of synthetic colorants

2.5.2 方法精密度

五種合成著色劑的 HPLC-MS檢測精密度試驗結果見表 3，相對標準偏差范圍在 0.3%～1.0%之間，表明本試驗建立的高效液相色譜質譜檢測方法精密度良好，重現性高，可應用于樣品檢測。

表3 HPLC-MS檢測精密度試驗結果Table 3 The precision result of HPLC-MS test

2.5.3 加標回收率

本研究測定小米、玉米糝子、發糕、玉米窩頭、蕎麥掛面五種不同的食物樣品，對合成著色劑測定結果為0的樣品加入日落黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅和亮藍5種合成著色劑，加標回收試驗結果見表4，加標回收率在81.5%～109.4%之間，說明采用方法1.3.1和1.3.2對樣品進行處理可有效減少合成著色劑的損失，能較好地提取和純化樣品中的合成著色劑。

表4 谷類食品中不同加標水平的平均加標回收率和相對標準偏差（n = 6）Table 4 Mean recoveries and R.S.D.s (n = 6) of three colorants from spiked food matrices at various fortification levels

2.6 實際樣品分析

將本文所開發的驗證方法應用于樣品中合成著色劑的測定。本研究中分析了來自寧夏市場和超市的 500多個小米、玉米粉、發糕、玉米窩頭、蕎麥掛面、玉米片、玉米糝子樣本。在測試樣本中，紫色發糕中檢出莧菜紅，樣品測試結果質譜圖如圖4所示。結果表明，該方法是一種比較合適的驗證方法。

圖4 紫色發糕中莧菜紅檢測質譜圖：4-1莧菜紅的選擇離子監測色譜圖；4-2莧菜紅的定量離子對和定性離子對色譜圖的重疊圖；4-3莧菜紅的二級質譜圖。Fig.4 MRM chromatograms of amaranth in purple steamed sponge cake: 4-1 the selective ion monitoring chromatogram of amaranth; 4-2 the overlapping diagram of quantitative and qualitative ion pairs of amaranth; 4-3the secondary mass spectra of amaranth

3 結論

本研究發現了小蘇打（碳酸氫鈉）的新用途，即在40%的甲醇水溶液里添加食用小蘇打，可以有效提取谷物加工品中的合成著色劑，解決了淀粉含量高而合成著色劑不易檢出的技術難題。與GB5009.35—2016《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》采用的聚酰胺法提取相比，本文開發的提取工藝測定結果具有較高的加標回收率，適用于液相色譜儀和液相色譜質譜儀同時淀粉含量高的谷物食品中合成著色劑的測定，為合成色素檢測時的前處理過程提供了一種參考方法。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中國知網、萬方、維普、超星等數據庫下載獲取。