太瑞斯梭孢殼霉磷脂酶C在玉米胚芽油脫膠中的應(yīng)用研究

胡婷婷，王 靈，林康森，江正強(qiáng)，楊紹青

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

玉米油富含多種脂肪酸，不飽和脂肪酸含量高達(dá)85%左右，其中亞油酸約占55%左右[1-2]。亞油酸作為一種人體自身不能合成的必需脂肪酸，具有降膽固醇、增強(qiáng)心血管機(jī)能、軟化血管、預(yù)防和改善動(dòng)脈硬化等功效[3]。經(jīng)壓榨離心制得的玉米胚芽油中磷脂含量較高，是毛油中主要的膠溶性雜質(zhì)，這些雜質(zhì)的存在不僅會(huì)降低油脂的流動(dòng)性、使用價(jià)值和貯藏穩(wěn)定性，而且在油脂精煉加工中還會(huì)導(dǎo)致成品油的質(zhì)量下降。因此，在油脂精煉過(guò)程中需進(jìn)一步去除磷脂組分[4]。

目前，植物油脂脫膠多采用傳統(tǒng)脫膠方法，如水化脫膠和酸法脫膠等[5-6]。傳統(tǒng)的脫膠方法可以有效地去除水化磷脂，但非水化磷脂很難去除[7]。酶法脫膠是通過(guò)添加磷脂酶將毛油中的非水化磷脂轉(zhuǎn)變?yōu)樗字阌诶盟姆椒ǔ8]。常用于植物油脫膠的酶有磷脂酶 A1（PLA1）、磷脂酶 A2（PLA2）和磷脂酶 C（PLC）。PLA2由于脫膠效果不突出且價(jià)格昂貴應(yīng)用較少，工業(yè)應(yīng)用中多選擇PLA1或PLC進(jìn)行植物油脂脫膠[9-11]。其中PLC具有很多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，根據(jù)側(cè)鏈基團(tuán)的不同，磷脂酶C可以分為磷脂酰膽堿特異性磷脂酶 C（PC-PLC）、磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C（PI-PLC）和非特異性磷脂酶C（NPC）。其中，PC-PLC可以特異性水解磷脂酰膽堿（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE），但對(duì)前者的底物特異性更好；PI-PLC只能特異性水解磷脂酰肌醇（PI），不能水解 PC；NPC則以普通磷脂為底物，可以水解PC、PE、磷脂酰絲氨酸（PS）、磷脂酰甘油（PG）和磷脂酸（PA）[11]。PLC脫膠水解產(chǎn)物為有機(jī)磷酸酯（磷酸膽堿、磷酸乙醇胺或磷酸肌醇等）及甘油二酯，脫膠過(guò)程不產(chǎn)生其它副產(chǎn)物，安全性更高，且脫膠過(guò)程中僅需1%～2%的水分，極大減少了廢水的產(chǎn)生，對(duì)環(huán)境污染相對(duì)較小，因此更受青睞[12]。目前，已有許多天然或重組PLC應(yīng)用于不同毛油脫膠，如玉米胚芽油[13]、大豆毛油[14]、菜籽毛油[15]、米糠毛油[16]、山茶毛油[17]和蔬菜毛油[18]等。葉展等[19]利用PLC處理菜籽油，菜籽毛油磷含量由693 mg/kg降低至7.85 mg/kg。Cerminati等[20]將球形芽孢桿菌 PI-PLC和商業(yè)PC-PLC復(fù)配對(duì)大豆毛油進(jìn)行脫膠，除去了約91%的磷脂。Jiang等[21]使用蠟狀芽孢桿菌PLC對(duì)山茶毛油脫膠，磷含量降至6.84 mg/kg，脫磷率達(dá)到98.2%。同時(shí)，部分商業(yè)PLC（PLC Purifine?和PLC Lecitase Ultra）也被應(yīng)用于毛油脫膠，包括大豆毛油和米糠毛油等[22-24]，但是關(guān)于玉米胚芽油酶法脫膠的報(bào)道相對(duì)較少[12,23]。

本課題組前期從太瑞斯梭孢殼霉（Thielavia terrestris）中克隆表達(dá)得到一種新型磷脂酶C。該酶應(yīng)用于大豆毛油脫膠，能完全除去PC和 PI，僅有極少部分的 PE殘留[11]。玉米胚芽油磷脂成分包括PC、PI、PA、PE等，主要為PC和PE，含量分別占20%以上。因此，使用對(duì)PC和PE底物特異性強(qiáng)的磷脂酶C利于脫膠完全[23]。本研究進(jìn)一步探究該酶在玉米胚芽油脫膠工藝中的應(yīng)用效果，優(yōu)化玉米胚芽油毛油酶法脫膠工藝的主要參數(shù)，以期為該酶的后續(xù)工業(yè)化應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

玉米胚芽油（磷含量 102.7 mg/kg）：中糧東海糧油工業(yè)張家港有限公司；太瑞斯梭孢殼霉磷脂酶C（TtPLC）：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室自制；重水 D2O、鉬酸鈉二水合物、氧化鋅、硫酸聯(lián)氨、脫氧膽酸鈉等試劑均為分析純：上海麥克林生化科技有限公司。

高速臺(tái)式離心機(jī)（TGL 12GB）：上海安亭科學(xué)儀器廠公司；全溫振蕩培養(yǎng)箱（HZQ-F160）：江蘇省太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠公司；慧泰智能馬弗爐（16-12TP）：上海慧泰儀器制造有限公司；封閉電爐（TDWYL-12）：滄州泰鼎恒業(yè)試驗(yàn)儀器有限公司；核磁共振波譜儀（Agilent 500 MHz DD2）：美國(guó)Agilent公司；水浴恒溫振蕩器（THZ-82A）、磁力加熱攪拌器：江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU 1800 PC）：北京普析通用儀器設(shè)備有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磷脂酶C的制備

參照Xiang等[11]方法制備太瑞斯梭孢殼霉磷脂酶 C。從本課題組篩選保藏的嗜熱真菌太瑞斯梭孢殼霉ThielaviaterrestrisCAU709克隆得到磷脂酶C基因，將其在畢赤酵母中進(jìn)行異源表達(dá)。依照Pichia Fermentation Process Guidelines（Version B，053002，Invitrogen）操作方法，在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵制備磷脂酶 C，制備得到的磷脂酶C酶活力為98 970?U/mL。

1.2.2 磷脂酶C活力測(cè)定

采用對(duì)硝基苯磷脂酰膽堿（p-NPPC）法測(cè)定磷脂酶C酶活力：將20 μL適當(dāng)稀釋的酶液加入到96孔板中，再加入180 μL含10 mMp-NPPC的50 mM HEPES pH 6.5緩沖溶液于55 ℃培養(yǎng)箱靜置。反應(yīng)30 min后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定410 nm下吸光度值。磷脂酶 C酶活力單位（U）定義為在上述條件下每分鐘反應(yīng)產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量。

1.2.3 玉米胚芽油的酶法脫膠

磷脂酶C應(yīng)用于玉米胚芽油的脫膠工藝參照J(rèn)iang等[25]的方法進(jìn)行。稱(chēng)取300 g玉米胚芽油于1 L燒杯中，水浴加熱至70 ℃，加入0.3 mL的檸檬酸溶液（45 %，w/w），在200 rpm條件下預(yù)熱處理 20 min。然后冷卻至預(yù)設(shè)溫度（25～50 ℃），加入一定量的4% NaOH溶液（w/v，0.3～2.4 mL）調(diào)節(jié)pH，再加入3 mL蒸餾水和一定量的磷脂酶C純酶液（0～10 000 U/kg），混合均勻后，在200 rpm搖床中反應(yīng)（0～4 h）。反應(yīng)結(jié)束后，將油樣置于沸水浴中處理10 min終止酶反應(yīng)，10 000 rpm離心10 min，取上層油樣測(cè)定磷含量。以加入滅活的酶液處理組作為對(duì)照組。

1.2.4 磷含量測(cè)定

參照國(guó)標(biāo)GB/T 5537—2008的方法測(cè)定磷含量。用坩堝稱(chēng)取3 g油樣，加入0.5 g氧化鋅在電爐上加熱至碳化后，置于馬弗爐中575 ℃灼燒2 h至完全灰化。取出坩堝冷卻至室溫，用10 mL鹽酸溶液（50%，v/v）溶解灰分并加熱至微沸，5 min后停止加熱，待溶解液溫度降至室溫后過(guò)濾注入100 mL容量瓶中，用5 mL熱水沖洗坩堝和濾紙3～4次，待濾液冷卻至室溫后用KOH溶液（50%，w/w）中和至出現(xiàn)混濁，緩慢滴加鹽酸溶液（50%，v/v）使氧化鋅沉淀全部溶解。最后用水稀釋定容。吸取10 mL被測(cè)液到50 mL比色管中，加入8 mL硫酸聯(lián)氨溶液（0.015%，w/v），2 mL 2.5%鉬酸鈉稀硫酸溶液（V(濃硫酸)∶V(水)=7∶25），加塞振搖3～4次，沸水浴處理10 min，冷卻至室溫后用水稀釋至刻度并充分搖勻，靜置10 min。最后用分光光度計(jì)測(cè)定溶液650 nm下吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)脫膠效果的影響

在初始條件酶添加量為5 000 U/kg，NaOH和檸檬酸體積比為4，溫度為35 ℃時(shí)，分別在反應(yīng)時(shí)間為0.5、1、2、3和4 h下進(jìn)行脫膠實(shí)驗(yàn)，以磷含量為指標(biāo)，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)玉米胚芽油脫膠效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 1，整體來(lái)看，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，磷含量逐漸下降，其中在0～1 h內(nèi)油脂磷含量下降顯著，反應(yīng)1～4 h期間，磷含量變化趨于平緩。綜合考慮脫膠率和脫膠時(shí)間，確定最佳反應(yīng)時(shí)間為1 h。

反應(yīng)時(shí)間對(duì)磷脂酶 C脫膠效果影響較大。Sampaio等[23]利用商業(yè)PLC Purifine?處理玉米胚芽油的最佳反應(yīng)時(shí)間為2 h。Xiang等[11]進(jìn)行大豆毛油磷脂脫膠時(shí)最佳的酶解時(shí)間與本研究結(jié)果一致。這是由于脫膠過(guò)程中磷脂發(fā)生凝聚，反應(yīng)時(shí)間過(guò)短，磷脂凝聚不完全，脫膠率較低，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，脫膠效果提高，反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)增加，脫膠效果不再提升，這是由于反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易發(fā)生油脂乳化，不利于磷脂的分離[15]。此外，酶活性也會(huì)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低[8]。因此，適宜的反應(yīng)時(shí)間能夠提高酶法脫膠的效果。

2.2 NaOH和檸檬酸的體積比對(duì)脫膠效果的影響

在初始條件酶添加量為5 000 U/kg，溫度為35 ℃，反應(yīng)時(shí)間為 1 h，檸檬酸添加量為 0.1%（v/w）時(shí)，通過(guò)添加適量體積的NaOH來(lái)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH，分別在NaOH和檸檬酸的體積比為1、2、4、6和8的條件下進(jìn)行脫膠實(shí)驗(yàn)，以磷含量為指標(biāo)，考察 pH對(duì)玉米胚芽油脫膠效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖 1，隨著 NaOH和檸檬酸體積比的增加，磷含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，當(dāng)NaOH和檸檬酸的體積比為4時(shí)，磷含量達(dá)到最低點(diǎn)。因此，確定NaOH和檸檬酸的最佳體積比為4。

圖1 NaOH和檸檬酸的體積比對(duì)玉米胚芽油脫膠效果的影響Fig.1 Effect of volume ratio of NaOH to citric acid on the degumming efficiency of crude corn oil

不同的酸堿比對(duì)玉米胚芽油脫膠效果有很大的影響。Xiang等[11]應(yīng)用磷脂酶C進(jìn)行大豆毛油磷脂脫膠最佳酸堿體積比為1 : 2。毛程鑫等[26]用磷脂酶對(duì)菜籽油進(jìn)行脫膠，最佳酸堿體積比為1 : 4.5。這可能是由于pH顯著影響酶的活性及酶促反應(yīng)速度，酶在其最適 pH條件下才能達(dá)到最高酶促反應(yīng)水平，當(dāng)酶在過(guò)低或過(guò)高pH條件下，酶結(jié)構(gòu)會(huì)受到破壞，酶的活性隨之降低甚至失去活性[8,20]。因此，采用適宜的酸堿比能有效提高酶法脫膠的效果。

2.3 溫度對(duì)脫膠效果的影響

在初始條件酶添加量為5 000 U/kg，NaOH和檸檬酸的體積比為4，酶解時(shí)間為1 h時(shí)，分別在25、30、35、40、45和 50 ℃下進(jìn)行脫膠實(shí)驗(yàn)，以磷含量為指標(biāo)，考察溫度對(duì)玉米胚芽油脫膠效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖 2，隨著反應(yīng)溫度的升高，磷含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)，磷含量達(dá)到最低點(diǎn)。因此，確定最佳反應(yīng)溫度為35 ℃。

圖2 溫度對(duì)玉米胚芽油脫膠效果的影響Fig.2 Effect of temperature on the degumming efficiency of crude corn oil

溫度也是影響酶法脫膠效果的重要因素之一。Qu等[9]進(jìn)行大豆毛油酶法脫膠時(shí)的最佳反應(yīng)溫度為55 ℃。Jiang等[21]進(jìn)行茶花籽油酶法脫膠的最適反應(yīng)溫度為 53 ℃。溫度過(guò)低，油脂流動(dòng)性降低，反應(yīng)物分子間結(jié)合不充分，酶促反應(yīng)較慢，隨著溫度的升高，油脂的流動(dòng)性越好，反應(yīng)物分子間結(jié)合越充分，酶促反應(yīng)速度越快，但是溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶變性，使酶的活性降低甚至完全不可逆的喪失活性[16,21]。因此，適宜的溫度范圍能顯著提高酶法脫膠效果。

2.4 酶添加量對(duì)脫膠效果的影響

在初始條件 NaOH和檸檬酸的體積比為 4，溫度為35 ℃，水解時(shí)間為1 h時(shí)，分別在酶添加量為 0、1 000、2 500、5 000、7 500和 10 000 U/kg的條件下進(jìn)行脫膠實(shí)驗(yàn)，以磷含量為指標(biāo)，考察酶添加量對(duì)玉米胚芽油脫膠效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，隨著加酶量的增加，磷含量逐漸降低，當(dāng)加酶量為5 000 U/kg時(shí)，磷含量達(dá)到最低點(diǎn)。綜合考慮，確定PLC脫膠最適加酶量為5 000 U/kg。

圖3 酶添加量對(duì)玉米胚芽油脫膠效果的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on the degumming efficiency of crude corn oil

本研究加酶量同Xiang等[11]大豆毛油磷脂脫膠結(jié)果一致，但是低于商業(yè)PLC Purifine?用于沙棘果油脫膠的酶添加量（12 000 U/kg）。這是由于在底物充足的情況下，酶促反應(yīng)速度與酶濃度大小成正比。酶濃度越高，酶促反應(yīng)速度越快，但是反應(yīng)速度并不會(huì)一直隨著酶添加量的上升而加快，因此，當(dāng)酶的濃度達(dá)到一定值時(shí)，催化速率曲線(xiàn)逐漸趨于平緩，之后再繼續(xù)增加酶的使用量時(shí)，反應(yīng)速率不再明顯變化[8]。

綜上所述，采用磷脂酶C對(duì)玉米胚芽油進(jìn)行磷脂脫膠的最佳條件為：酸堿比為 4、反應(yīng)溫度為35 ℃、反應(yīng)時(shí)間為1 h、加酶量為5 000 U/kg。在該最優(yōu)條件下，玉米胚芽油中磷的含量降低到24.0 mg/kg，水解率為76.6%。該酶的脫膠效果優(yōu)于帝斯曼公司的 DSM磷脂酶 C（商業(yè)酶，64.70 mg/kg）[23]和商業(yè) PLC Purifine?（27 mg/kg）[26]，稍差于其它幾種磷脂酶（表2）。但是從檸檬酸的使用量來(lái)看，本研究中的使用量?jī)H為其它脫膠工藝的50%左右（表2）。因此，綜合考慮本研究的酶活力、脫膠效果和檸檬酸的用量，重組磷脂酶C（TtPLC）在玉米胚芽油脫膠工業(yè)中具有較大的應(yīng)用潛力。

表2 部分磷脂酶酶法脫膠效率比較Table 2 Comparison of enzymatic degumming efficiencies of partial phospholipases

3 結(jié)論

采用自制的太瑞斯梭孢殼霉磷脂酶 C，優(yōu)化了玉米胚芽油酶法脫膠工藝。得到最佳工藝參數(shù)為：NaOH和檸檬酸的體積比為 4、溫度為35 ℃、加酶量為5 000 U/kg和水解時(shí)間1 h。在最佳條件下，玉米胚芽油脫膠效果顯著，磷含量由 102.7 mg/kg降低至 24.0 mg/kg，水解率為76.6%。PLC脫膠不僅安全性高，水解產(chǎn)物為有機(jī)磷酸酯及甘油二酯，不產(chǎn)生其它副產(chǎn)品，而且環(huán)境友好，脫膠過(guò)程用水量少（僅需1%～2%的水分），可顯著減少?gòu)U水排放量。因此太瑞斯梭孢殼霉磷脂酶C在玉米胚芽油酶法脫膠工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。