基于微波水解-離子色譜的香菇多糖組成指紋圖譜研究

趙秀婷，張 欣，付 萌，李進偉，朱 松，范柳萍

（1.無限極（中國）有限公司，江門 529100；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，無錫 214122）

多糖是由 10個或以上單糖通過縮合而形成的鏈狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，在動植物和微生物中廣泛分布，對維持正常生命活動至關(guān)重要[1-2]。而多糖中單糖組成分析是研究多糖的結(jié)構(gòu)性質(zhì)及對其進行質(zhì)量控制的重要內(nèi)容。

目前常用的多糖水解方法是加熱酸水解法，加熱方式常采用烘箱加熱，該方法耗時長、能耗大，且受熱不均勻，導(dǎo)致水解樣品重復(fù)性很差，遠遠不能滿足研究的需求。而微波水解是將樣品、酸置于微波電磁場中，微波頻率使極性分子取向快速變換，分子在來回轉(zhuǎn)動過程中與周圍分子高速碰撞摩擦，增加總能量，產(chǎn)生高熱[3]。微波水解方法能使樣品受熱均勻，加快水解速度，降低能耗，降低檢測成本[4]。

對水解后的多糖進行單糖組成分析，常用的方法有氣相色譜法[5]、高效液相色譜法[6]等。由于單糖的揮發(fā)性低，難氣化，氣相色譜法測單糖時必須對其進行硅烷化或酯化等衍生化處理，操作繁瑣。采用高效液相色譜法檢測單糖時最常用的是示差折光檢測器，但這種檢測器的靈敏度低、基線易受溫度影響產(chǎn)生大的波動、不能進行梯度洗脫[7]，而采用靈敏度較高的紫外檢測器檢測時，則需對單糖進行衍生化反應(yīng)，操作繁瑣[8]。近年來，高效陰離子交換色譜被廣泛用于糖的檢測，這是由于糖類分子具有高的電化學(xué)活潑性，且在強堿溶液中全部或部分電離成陰離子形式[9]，可以在陰離子交換柱上被保留并得到分離[10]。由于糖在金電極上易發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生信號，離子色譜法檢測糖主要使用金電極的脈沖安培檢測器[11]。該檢測器檢測糖非常靈敏，操作簡便，檢測限可以達到pmol/L，而且不需衍生反應(yīng)和復(fù)雜的樣品處理。

本文將微波水解和離子色譜分析相結(jié)合，建立一種快速、高效、準(zhǔn)確的多糖組成的分析方法。并采用這種方法構(gòu)建香菇多糖組成的離子色譜指紋圖譜，通過多糖的單糖組成的分析對香菇多糖的生產(chǎn)進行質(zhì)量監(jiān)控，彌補現(xiàn)行質(zhì)量監(jiān)控上的不足。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氫氧化鈉（NaOH）溶液（50%，w/w）：瑞士Fluka公司；三氟乙酸（TFA）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、無水乙醇均為分析純：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙腈，色譜純：美國TEDIA公司；巖藻糖（Fuc）、鼠李糖（Rham）、氨基葡萄糖（GlcN）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）、木糖（Xyl），果糖（Fru）、核糖（Rib）標(biāo)準(zhǔn)品：美國 sigma-aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS-5000+離子色譜儀，配有雙泵(DP)模塊、檢測器/色譜(DC)模塊、自動進樣器(AS)模塊、Chromeleon 7.0色譜工作站：美國Thermo Fisher公司；Waters 2695高效液相色譜儀，配有Waters2489紫外檢測器、Empower色譜工作站：美國Waters公司；CEM Mars6高通量密閉微波消解儀，配有消解罐：美國 CEM 公司；Milli-Q Advantage A10超純水機：美國Millipore公司；5424離心機：德國Eppendrof公司；LE204E分析天平：梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 香菇多糖樣品的制備

取10 mL濃縮香菇多糖產(chǎn)品放入50 mL離心管中，加入30 mL無水乙醇，充分搖勻后，在4 000 r/min下離心10 min，除去上清，沉淀用80%乙醇（30 mL）溶解，充分混勻后，在4 000 r/min下離心10 min，除去上清，在60 ℃下烘干，備用。

1.3.2 微波水解香菇多糖條件優(yōu)化

以三氟乙酸濃度、微波溫度、微波時間、物料比為單因素，進行優(yōu)化實驗。準(zhǔn)確稱取20 mg烘干后的香菇多糖樣品放入微波消解罐中，每次實驗僅改變一個條件，其他條件固定不變。分別將三氟乙酸濃度設(shè)置 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mol/L五個水平；微波溫度設(shè)置100、110、120、130、140 ℃五個水平；微波時間設(shè)置10、20、25、30、35、40 min五個水平；物料比設(shè)置5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL的三氟乙酸（3.0 mol/L）。設(shè)定微波功率1 600 W，微波水解后水解液稀釋1 000倍，進行離子色譜分析。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取10 mg的半乳糖、巖藻糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、核糖標(biāo)準(zhǔn)品，用水定容于10 mL容量瓶中，配成1.000 g/L儲備液，于冰箱中保存，使用時將儲備液稀釋至系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.4 離子色譜條件

色譜柱：Thermo CarboPac PA20 (150 mm×3 mm i.d.) 陰離子交換柱，配有保護柱 (30 mm×3 mm)；柱溫：30 ℃；進樣體積：20 μL。以0.25 mol/L NaOH和水為流動相進行梯度洗脫，流速：0.5 mL/min，淋洗條件見表1。脈沖安培檢測器采用糖標(biāo)準(zhǔn)四電位波形。

表1 梯度洗脫表Table 1 Gradient elution conditions

1.3.5 離子色譜方法學(xué)研究

1.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限 精密稱取各單糖標(biāo)樣適量，用水配置成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用以上離子色譜條件分析。以各標(biāo)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各標(biāo)樣的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。

1.3.5.2 重復(fù)性、穩(wěn)定性研究 平行制備水解多糖樣品溶液6份，采用離子色譜條件分別分析，計算6個樣品中各單糖峰面積的平均值及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

取稀釋至合適濃度的水解多糖樣品，在0、2、4、6、8、12、24 h采用離子色譜分析，計算樣品中各單糖峰面積的平均值及RSD。

1.3.5.3 準(zhǔn)確性研究 取已知單糖組成含量的多糖樣品9份，分別加入高、中、低3個濃度的混合單糖標(biāo)液，微波水解，離子色譜分析，測定其回收率及RSD。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，每個實驗至少重復(fù)三次。數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用SPSS 19.0軟件進行One-Way ANOVA分析，以及Tukey’s多重檢驗，P＜0.05被認為數(shù)據(jù)差異顯著。采用Origin軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與討論

2.1 微波水解香菇多糖條件優(yōu)化

2.1.1 三氟乙酸濃度對香菇多糖水解的影響

改變?nèi)宜岬臐舛龋３制渌麠l件不變。由圖 1A我們能夠發(fā)現(xiàn)：當(dāng)三氟乙酸的濃度小于3.0 mol/L時，水解液中單糖總量與三氟乙酸的濃度呈正相關(guān)；當(dāng)三氟乙酸的濃度為3.0 mol/L時，單糖總量達到最大值；再增加三氟乙酸的濃度，水解液中單糖總量的下降，因此，最佳三氟乙酸反應(yīng)濃度為3.0 mol/L。

2.1.2 微波溫度對香菇多糖水解的影響

改變微波溫度，保持其他條件不變。由圖1B我們能夠發(fā)現(xiàn)：隨著溫度的提高，水解液中單糖總量先增加；當(dāng)溫度提高到130 ℃以上，單糖總量逐漸下降。同時考慮到過高的溫度造成爬升溫度時時間的延長及成本的提高，選擇微波溫度為130 ℃。

2.1.3 微波時間對香菇多糖水解的影響

改變微波水解時間，保持其他條件不變。由圖 1C我們發(fā)現(xiàn)：隨著時間的延長，水解液中單糖總量先增加；當(dāng)時間達到30 min以上時，單糖總量下降并逐漸趨于平緩，因此，選擇的最佳微波水解時間為30 min。

2.1.4 物料比對香菇多糖水解的影響

考慮到CEM Mars6高通量密閉微波消解儀的使用情況，我們設(shè)置了 5、6、7、8、9 mL共 5個三氟乙酸的體積，其他條件均不變，改變物料比。由圖 1D我們能夠發(fā)現(xiàn)：隨著三氟乙酸體積的增加，水解液中單糖總量增加；當(dāng)三氟乙酸的體積高于 7 mL時，單糖總量逐漸下降。因此，最佳三氟乙酸的體積為7 mL。

圖1 三氟乙酸濃度（A）、微波溫度（B）、微波時間（C）和物料比（D）對香菇多糖水解的影響Fig.1 Effects of trifluoroacetic acid concentration (A), microwave temperature (B),microwave time (C) and material ratio (D) on lentinan hydrolysis

經(jīng)過單因素實驗分析，得到微波水解的最佳使用條件為：三氟乙酸的濃度：3.0 mol/L；微波溫度：130 ℃；微波水解時間：30 min；物料比：20 mg樣品：7 mL三氟乙酸。

2.2 離子色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

目前用于分離單糖和小分子低聚糖的陰離子交換色譜柱主要有CarboPac PAl、CarboPac PA10和CarboPac PA20三種。通過實驗比較了這3種色譜柱對樣品中可能存在的 7種糖類的分離效果。實驗發(fā)現(xiàn)，在色譜柱CarboPac PA1和CarboPac PA10上，甘露糖和木糖不能較好分離，而在CarboPac PA20上可以達到基線分離。這是由于CarboPac PA20色譜柱樹脂基核及覆蓋在樹脂表面的鍵合季胺基團的乳膠比CarboPac PA10小，分析速度快，柱效高，有更大優(yōu)勢[9]。故本實驗選擇CarboPac PA20柱進行相關(guān)測定。

2.2.2 流動相NaOH的濃度對離子效果的影響

在強堿條件下能夠使糖以陰離子的形式存在，高 pH阻礙了糖分子間氫鍵的行程，使糖分子可與固定相相互作用，故改變NaOH濃度，會影響糖分子與固定相之間的作用程度，從而影響保留時間和響應(yīng)值[12]。保證其他條件不變的情況下，分別考察3.75、5.00和6.25 mmol/L NaOH淋洗液對9種糖的分離效果，結(jié)果如圖2。甘露糖和木糖在NaOH濃度為5.00 mmol/L和6.25 mmol/L時不能分離。而各種糖只有在濃度為3.75 mmol/L的NaOH溶液下才能在 20 min的分析時間內(nèi)達到較好的分離效果。隨后升高 NaOH濃度為200 mmol/L，沖洗掉樣品中在色譜柱上強保留的組份，達到再生色譜柱的目的，保證離子色譜檢測的穩(wěn)定性。

圖2 不同洗脫條件下各種糖的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatograms of various sugars under different elution conditions

2.2.3 柱溫對離子效果的影響

柱溫是極易影響離子色譜分析法分離的一個重要參數(shù)，改變柱溫能夠改變液液傳質(zhì)速率，導(dǎo)致分離柱的理論塔板高度的變化，從而對樣品的保留時間產(chǎn)生影響，直接影響到分析物質(zhì)中各組分在色譜柱上保留時間及分離程度[13-14]。本實驗比較不同柱溫（25、30和 35 ℃）下，各種糖的保留程度，特別是難分離物質(zhì)氨基葡萄糖和半乳糖以及甘露糖和木糖的保留和分離的影響。由圖3可知，在柱溫為25 ℃時，糖的保留時間均延長，其中氨基葡萄糖和半乳糖不能分離。在柱溫為35 ℃時，糖的保留時間均縮短，但甘露糖和木糖又不能分離。在柱溫為30 ℃時，各種糖組份都能夠達到基線分離。因此，選定色譜柱溫度為30 ℃。

圖3 不同溫度下各種糖的離子色譜圖Fig.3 Ion chromatograms of various sugars at different temperatures

2.3 微波水解–離子色譜法與常規(guī)水解–PMP衍生化–液相色譜法比較

常規(guī)水解–PMP衍生化–液相色譜法是目前多糖單糖組成常見的檢測方法，我們將建立的微波水解–離子色譜法與其在分析時間和分析結(jié)果方面進行了比較。結(jié)果表明，利用微波輻射的“內(nèi)加熱”作用，能加快水解的作用，且不需要對水解樣品進行衍生化反應(yīng)，整個樣品的分析時間從360 min縮短至65 min，大大提高了分析效率。分析結(jié)果比較表明，微波水解–離子色譜法的回收率略高于常規(guī)水解–PMP衍生化–液相色譜法，微波水解–離子色譜法含量分析結(jié)果比常規(guī)水解–PMP衍生化–液相色譜法多8.54%，差別并不顯著。說明微波水解多糖與常規(guī)烘箱加熱法相比，主要是能提高水解效率，而對水解產(chǎn)物無顯著影響。

表2 微波水解–離子色譜和常規(guī)水解–PMP衍生化–液相色譜法分析時間比較Table 2 Comparison of analysis time by the microwave hydrolyzation–ion chromatography and the conventional hydrolyzation–PMP derivatization-liquid chromatography

表3 微波水解–離子色譜和常規(guī)水解–PMP衍生化–液相色譜法分析結(jié)果比較Table 3 Comparison of analysis results by the microwave hydrolyzation–ion chromatography and the conventional hydrolyzation–PMP derivatization-liquid chromatography

2.4 離子色譜方法學(xué)研究

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限

9種單糖的質(zhì)量濃度 x (mg/L)與其峰面積 y(nC· min)在0.05～80 mg/L范圍內(nèi)具有很好的線性關(guān)系，線性系數(shù)R2均大于 0.998 5（如表 4）。9種糖的檢出限(20 μL 進樣，S/N = 3)在 2.0～9.0 μg /L范圍內(nèi)。證明該方法檢測線性很好，線性范圍較寬，檢測靈敏度很高。

表4 9種單糖的檢出限及線性關(guān)系Table 4 Detection limit and linear relationship of 9 monosaccharides sample

2.4.2 方法精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性

標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進樣5次測定色譜峰峰面積，計算9種單糖的峰面積的RSD為1.32%～4.58%；取合適濃度的水解多糖樣品，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進行測定，計算各峰面積得RSD為1.45%～4.99%；平行制備水解多糖樣品溶液6份，經(jīng)水解、稀釋后進行測定，RSD為1.31%～5.07%。以上結(jié)果表明，該方法精密度高、穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好，可應(yīng)用于多糖水解樣品中9種單糖的分析。

2.4.3 準(zhǔn)確度實驗

分別加高、中、低 3個濃度的混合氨基酸對照品溶液各3份于已知含量的供試品溶液中，測其回收率，實驗結(jié)果表明各單糖于各濃度下的回收率均在80.4%～95.0%之間，RSD為2.36%～4.57%，說明本方法測定多糖水解液中各單糖含量回收率良好，準(zhǔn)確度高。

2.5 香菇多糖離子色譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建

2.5.1 香菇多糖離子色譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜

將 106個香菇多糖樣品的離子色譜圖譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成CDF格式，導(dǎo)入指紋圖譜專用軟件“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，見圖4。經(jīng)多點校正、色譜峰匹配等軟件處理方法生成香菇多糖離子色譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，見圖5。

圖4 香菇多糖的離子色譜圖譜Fig.4 Ion chromatogram of lentinan

圖5 香菇多糖的離子色譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜Fig.5 Standard fingerprint of ion chromatograms of lentinan

2.5.2 單糖標(biāo)準(zhǔn)品對照定性共有峰中的單糖峰

對照上述在同樣離子色譜條件下分析得到的9個單糖混合標(biāo)樣的色譜圖見圖6A，比較圖中各峰的相對保留時間，可以確定香菇多糖指紋共有特征峰中有6個是單糖峰，依次為巖藻糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖。

圖6 9種單糖標(biāo)樣（A）和香菇多糖樣品（B）的離子色譜圖Fig.6 A: Ion chromatograms of 9 monosaccharides standard sample; B: Ion chromatograms of lentinan sample

對 106批次香菇多糖樣品進行相似度評價，均在0.95以上，說明各批次間相似度良好，離子色譜指紋圖譜可作為香菇多糖質(zhì)量控制和評價指標(biāo)的重要參考依據(jù)之一。

3 結(jié)論

采用微波輔助酸水解法對香菇多糖樣品進行前處理，離子色譜檢測，優(yōu)化了微波水解多糖條件和離子色譜條件，與常規(guī)水解–PMP衍生化–液相色譜法相比，該方法每個樣品的分析時間由原來的365 min縮短到65 min。方法學(xué)研究表明該方法準(zhǔn)確性高，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好，可應(yīng)用于香菇多糖樣品的單糖組成分析。采用該方法對多批次香菇多糖樣品進行分析，構(gòu)建基于多糖單糖組成信息的離子色譜指紋圖譜，為香菇多糖的質(zhì)量控制提供更全面的參考。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。