肉羊鮮精常溫保存技術的研究

張良斌，賀心康，劉自運，柴 局，布魯呼木圖，張新杰，翟太宇，張仙保*

（1.包頭市農牧業科學研究院，內蒙古包頭014013；2.包頭市九原區家畜改良工作站，內蒙古包頭014000；3.包頭市九原區動物檢疫監督所，內蒙古包頭014000；4.包頭市城鄉統籌一體化促進中心，內蒙古包頭014000）

隨著畜牧業產業化的發展，生產優質肉羊是適應國際市場的需要。我國的肉羊產業起步較晚，目前還沒有形成肉羊的繁育體系。肉羊品種多為地方品種，產肉性能較差、羊肉品質也較低、市場的競爭力相對較弱。近年來，我國已引入德國肉用美利奴、南非肉用美利奴、杜泊、薩福克、特克塞爾、無角道賽特等優質肉羊品種，利用引入的肉羊品種與當地綿羊品種雜交進行改良，取得較好的養殖生產效果[1]。為提高引進肉用種公羊的利用率，逐漸擴大肉用羊的繁育數量，采用鮮精低溫保存的方法進行人工授精是比較直接有效的方法。鮮精低溫保存技術延長肉羊精子的存活時間，提高了優良種公羊精液的利用率，擴大配種范圍[2]。但是，采用低溫保存的精液解凍之后，精子的活性以及精子的完整率均較低，對于后期受精率有較大影響[3]，且冷凍保存的條件較為苛刻，通常是在4℃低溫保存[4-5]，輸精需要攜帶冰箱，導致工作人員的工作強度較大、成本較高。

養殖生產中，為解決精液保存問題，本試驗通過參考鮮精低溫保存技術[6]，以卵黃和海藻糖作為單一變量進行研究，從而確定肉羊鮮精常溫保存配方，保證運輸與人工授精的時間和精子活率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

卵黃（雞蛋）購自當地超市，自生產日期不超過15 d。

三羥基氨基甲烷（Tris）、檸檬酸鈉、維生素C、還原型谷胱甘肽、牛血清白蛋白、三磷酸腺苷（ATP）、青霉素、鏈霉素、海藻糖均購自北京酷來搏科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 精液的采集

試驗羊由包頭市九原區鑫泰農業科技有限責任公司提供，為膘情中等、體質健康、性欲旺盛的無角多賽特種羊，卵黃組和海藻糖組各5只，每只羊做3個重復。

使用假陰道法采集精液，確保精液不受污染，將采集的精液在放置顯微鏡下觀察并測定精子的活率，鏡檢合格后進行常規品質評定。精子活率大于80%、無異味、色澤純白或灰白，作為試驗樣品。

1.2.2 精液活率的測定

將檢測合格的種公羊精液與37℃預熱的稀釋液按照1∶3的比例進行稀釋，稀釋過程中要保證溫度穩定在37℃左右，以免溫差造成精子活率下降。分別比較在保存第1、2、3、4 d精子的活率，保存方式為常溫（20~25℃）保存。

精子活率檢測：將稀釋精液搖勻后取10μL中層精液滴于經預熱的37℃恒溫血細胞計數板上，蓋片后置于顯微鏡下放大400倍，檢查精子總量和活精數量，計算精子活率。

1.2.3 精液緩沖劑的配制

卵黃組：取3~9 g Tris、0.8~2.8 g檸檬酸鈉、0.1~0.8 g維生素C、0.01~0.09 g還原型谷胱甘肽、0.06~0.28 g牛血清白蛋白、0.02~0.15 g ATP、10~80萬IU青霉素、5~30萬IU鏈霉素、海藻糖1.75 g加入20 mL雙蒸水，用玻璃棒攪拌均勻。將雞蛋打入干凈燒杯（雞蛋不可打散），用沒有針頭的注射器插入蛋黃內吸取蛋黃液加入上一步配制的液體中，組配制好的溶液加入雙蒸水配制為100 mL的溶液，用玻璃棒攪拌混勻。蛋黃分5組，每組加入量分別為5、10、15、20、25 mL。

海藻糖組：卵黃15 mL，海藻糖分為6組，每組加入量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g；剩余物質的含量與卵黃組成分一致。

1.3 數據統計與分析

利用SPSS 25.0軟件對試驗所得數據進行單因素方差分析（One-way ANOVA），采用鄧肯氏法對組間數據進行多重比較，結果以“平均值±標準差”表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同含量海藻糖對肉羊精子活率的影響（見表1）

使用血液計數板按照24 h間隔對精液進行檢測，共檢測4 d的樣本。

由表1可知，24 h檢測顯示，6個不同含量的海藻糖條件下精子活率均高于80%，96 h檢測結果顯示，6個不同含量的海藻糖條件下精子活率均高于40%，其中海藻糖含量在2 g時，精子活率最高，達52.56%。24、48、96 h時，海藻糖含量為2 g時，肉羊精子活力最高（P<0.05）；72 h時，海藻糖含量為1.5 g時，肉羊精子活力最高（P<0.05）。

表1 不同含量海藻糖對肉羊精子活率的影響Tab.1 Effects of different trehalose content on sheep sperm motility 單位：%

2.2 不同含量卵黃對肉羊精子活率的影響（見表2）

由表2可知，24 h檢測結果顯示，5個含量卵黃條件的精子活率均高于80%，10 mL卵黃含量下，高達92.37%；96 h檢測結果顯示，5個含量卵黃條件下的精子活率均高于40%，其中卵黃含量為10 mL時，精子活率最高，達56.04%。

表2 不同含量卵黃對肉羊精子活率的影響Tab.2 Effect of different egg yolk content on sheep sperm motility 單位：%

3 討論

20世紀50年代，-79℃條件下，綿羊精液保存技術獲得較高的存活率[7]，但產羔率僅5%，說明冷凍后的精液雖然有較高的存活率，但是精子的受精能力卻遭到嚴重破壞。在0~4℃的低溫保存下，綿羊精子可存活長達167 h[3-4]。費俊陽等[6]研究表明，在0℃冰水混合的條件下，精子保存12 d的活率在70%以上。孔凡虎等[8]報道，鮮精常溫保存（20~25℃）中稀釋液的成分主要包括糖類、奶類、卵黃、緩沖物質、抗生素及其他成分。本試驗中，糖類選擇海藻糖，海藻糖能有效維持細胞內生物膜、蛋白質、活性肽的穩定性和完整性。海藻糖不僅是穩定性的雙糖，在代謝過程中也是主要提供能量的物質；還能有效保護DNA，保證精子基因的完整性[9-10]。由于當前市場上的牛奶大多含有防腐劑等成分，會影響精子的活性，使用鮮奶保存精液的限制性較大。因此，選擇雞蛋維持精子活力、保護精子頂體等，雞蛋即不含化學添加物，又能保證無菌性[11]。

本試驗選擇11月份進行試驗，主要是在本地區該時間段是養殖場進行同期發情和人工授精等的交配期，該時期進行試驗能夠與生產實際應用緊密結合。本試驗從2019年2月開始。前期包括對采精方式進行探索，包括使用附睪孵育法、電刺激采經法以及假陰道采精法。3種方法中，附睪孵育法對于試驗要求比較嚴格。據報道，公羊附睪的精子要比射出精液的精子對冷刺激適應性強[12-13]。但是，由于精子含量以及精子的活躍狀態均明顯比另外2種方法差，因此該試驗方法首先被淘汰。電刺激采精[14]由于具有麻痹性而且是被動射精，影響精液的品質[15-16]，因此得到的精液濃度低，精子活性也較低。最終，本試驗選用假陰道采精法進行采精。

本次試驗結果相對穩定。不同含量卵黃條件下，卵黃含量為10 mL時，精子活率的穩定性以及第4 d數值均比較好，第4 d的精子活率在50%以上，符合實際生產中授精的活力必須高于40%。不同含量海藻糖條件下，海藻糖含量為2 g時，精子活率在4 d連續測試的活率處于5個含量梯度最高，并且降幅相對穩定，在第4 d高于50%以上，也符合實際生產需求。研究發現，在72 h時1.5 g海藻糖條件下要比2 g含量下精子活率略高，可能由于在該時間段2 g海藻糖含量略大，精子內外滲透壓要比1.5 g含量的高，對精子吸收外界的物質均有影響，而低含量下的海藻糖會對精子受滲透壓的影響較小。高滲壓會使精子輕度脫水，減緩新陳代謝速度，使活性精子運動減少[17]，會引起細胞器和細胞膜受損[18]，導致細胞膜上的磷脂質丟失嚴重[19]，并會改變胞內pH值[20-21]，增加精子的死亡率。因此，下一步研究應該考慮精子受滲透壓的影響，探討各種保存劑的最佳濃度。

4 結論

按照鮮精輸精精子活率必須達到40%以上的要求，根據試驗結果，卵黃的含量在10 mL的情況下精子活率較好，海藻糖在2 g含量下精子活率較好。