雞胚卵內注射技術研究進展

李元昊，龐舒琪，王鵬程，姜立山，陳立思，魏 紫，胡庭俊，于美玲

（廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧530005）

卵內注射技術最初是肉雞場接種馬立克氏病毒疫苗的一種疫苗接種技術[1]。1992年，Embrex公司研發出第一臺自動化卵內注射器，每小時可以接種25 000~62 000個雞蛋。隨著雞胚注射技術快速發展，新型的注射制劑因能提高雞的免疫力、營養物質吸收能力和生長性能。近5年，卵內注射外源物質的研究主要集中于以下7個方向：疫苗、維生素、氨基酸、礦物質、益生菌、益生元和合生元。

1 雞胚卵內注射疫苗

隨著卵內注射疫苗的深入，Peebles[2]研究表明，雞胚孵化后期卵內注射疫苗安全可靠，且通過雞胚卵內注射疫苗可以快速誘導機體產生免疫反應，使新生雛雞更早獲得抗體保護。

1.1 馬立克氏病疫苗

1982年，Sharma等[3]發現，卵內接種馬立克氏病疫苗的雛雞比孵化后，再接種馬立克氏病疫苗的雛雞抵抗馬立克氏病毒感染的能力更強，保護指數可達85。美國超過80%的雞場通過卵內注射馬立克氏病疫苗控制馬立克氏病[4]。Peebles等[5]研究發現，相對于皮下注射馬利克氏病疫苗，卵內注射可以獲得更高的嫩肉比率。

1.2 球蟲病疫苗

艾美球蟲會在動物腸道內發育，引發疾病和死亡，導致飼料轉化率和體重增長率降低，使禽類易患繼發性疾病，如壞死性腸炎。Sokale等[6]發現雞胚注射時間影響球蟲疫苗的注射位置，影響雛雞的質量。雞胚卵內注射高劑量的球蟲疫苗會降低孵化后雛雞的生長性能[7]；而注射適當劑量的球蟲疫苗無副作用，是預防該疾病的最佳方法。

1.3 雞毒支原體疫苗

雞毒支原體可感染不同日齡和不同品種的雞，造成雞產蛋量下降。Elliott等[8]發現，給孵育第18 d的雞胚卵內注射雞毒支原體疫苗，在孵化后6周齡雞體內仍然可以檢測到較高水平的抗體，與減毒支原體苗皮下注射相比，雞胚卵內注射疫苗誘導產生的抗體水平更高。卵內注射雞毒支原體減毒活疫苗可引起病原水平傳播[9]；雞胚卵內注射最低劑量（1×CFU/只）的雞毒支原體疫苗才能保證胚胎孵化率和出生后存活率[10]。

2 雞胚卵內注射維生素

維生素E最早被用于卵內注射以增強肉雞的體液和細胞免疫能力。近幾年的研究對象主要為：維生素C、維生素D3和維生素E。

2.1 維生素C

維生素C具有抗氧化功能，對癌癥、男性不育、退行性神經疾病等有治療作用，對精神焦慮癥有緩解作用[11-15]。研究表明，雞胚卵內注射維生素C可以提高雛雞脾臟內干擾素-γ（IFN-γ）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、抗腫瘤因子-α（TNF-α）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）的mRNA表達水平[16-17]，提高雛雞的抗氧化能力和免疫力。卵內注射維生素C還能提高熱休克蛋白的分泌量，降低高飼育溫度帶來的雛雞堿中毒的風險[18]，減少由于高飼育溫度帶來的生產損失。在孵育第11 d的時候卵內注射維生素C可以增加孵育第16 d和第18 d的熱休克蛋白和代謝基因的表達，降低孵化后期胚胎過熱的風險[19]。給孵育第11 d雞胚卵內注射3 mg維生素C，可以提高肉雞生長早期體內維生素C的含量，改善肉雞生長性能和肉品質[20]。研究表明，雞胚卵內注射維生素C對雞胚孵化率無影響[21]，但雞胚卵內注射維生素C對雞胚孵化時間的影響有待進一步研究。

2.2 維生素D3

維生素D3可參與小腸鈣吸收[22-23]、維持鈣穩態[24-25]、調控成骨細胞增殖分化[26]、影響骨骼代謝、促進骨骼生長發育。Hayakawa等[27]發現，卵內注射維生素D3可提高雌性淺胸肌中類胰島素一號（IGF-1）受體的mRNA表達水平，使肝臟IGF-1受體的維生素D3區域的mRNA的表達量升高。Fatemi等[28]發現，通過向孵育第18 d的雞胚注射維生素D3，可以提高雞胚胎血清中的25-羥基膽鈣化固醇（維生素D3在肝臟中的中間產物）的濃度；同時也發現，相對于雞胚卵內注射維生素D3，卵內注射25-羥基膽固醇鈣化醇的卵黃沉積形態和肉雞的生長性能更好，且不影響雞胚溫度[29]。

2.3 維生素E

維生素E是細胞內抗氧化劑，可以防止不飽和脂質物質氧化，從而保護細胞膜免受氧化損傷。缺乏維生素E時，會引發脂質過氧化直接損傷組織細胞[30]。雞胚注射維生素E可以提高雞胚的孵化率，并提高雛雞的出生體重[31]。Araújo等[31]通過對孵育第17 d的雞胚進行羊膜腔注射維生素E，可提高雛雞出生體重，提高飼料轉化率，但沒有增加脾臟或法氏囊重量或脾臟白髓的百分比，且由于該試驗并沒有測試熱應激狀態下的肉雞防御系統狀態，因此該試驗中雞胚注射維生素E沒有展現出改善防御系統的能力。

3 雞胚卵內注射氨基酸

最初進行卵內注射氨基酸的目的是提高肉雞生長性能。隨著研究的深入，發現卵內注射氨基酸可以提高肉雞免疫力和改善肉質。近5年關于L-型精氨酸和含硫氨基酸的研究取得一些突破性進展。

3.1 L-型精氨酸

L-型精氨酸是肉雞生長的必需氨基酸，但由于雞體內缺乏合成L-型精氨酸的相關酶，因而雞無法通過內源性合成獲得L型精氨酸[32]。通過卵內注射適當劑量的L-型精氨酸能提高雛雞的孵化率、免疫力、存活率[33]，還可以增加雞蛋內部的胚胎肌肉量，從而增加雞胚重量[34]。多項研究表明，卵內注射L型精氨酸可以提高雛雞的飼料轉化率和采食量，甚至能促進雛雞腸道內益生菌群的構建，從而發揮促進其生長的作用[35-38]。

3.2 含硫氨基酸

通過對孵育第17.5 d的雞胚卵內注射含硫氨基酸，可以提高GSH-Px基因的表達水平，提高機體抗氧化能力，改善脂質分布和降低皮質酮濃度，從而減輕雛雞熱應激和氧化應激損傷[39]。

4 雞胚卵內注射礦物質

雞胚孵化早期，由于骨骼的生長發育，雞胚對礦物質的需求量高，但雞胚孵化早期的主要能量來源是卵黃，卵黃內的微量元素通常不足以支持雞胚早期的骨骼生長[40]。Oliveira等[41]研究發現，卵內注射有機礦物質有利于增加骨骼的重量。近5年卵內注射的礦物質主要是銅和鋅。

4.1 銅

銅（Cu）是涉及多種生理過程的關鍵微量礦物質，在生產過程中大多數Cu會隨家禽糞便排出體外。Mroczek-Sosnowska等[42]發現，對1胚齡雞胚氣室注射銅可提高肉雞的銅利用率，卵內注射銅可顯著提高肉雞體重，降低肉雞的料重比和死亡率。卵內注射納米銅和硫酸銅可以減少雞腿中水分的含量，在不降低蛋白質含量的情況下增加脂肪的含量，從而達到提高肉質的目的，還可通過降低雛雞骨骼內羥基賴氨酸的含量，從而增強雛雞抗骨折的能力[43]。采取卵內注射銅元素可減少由飼料添加銅元素引起的環境污染。

4.2 鋅

鋅作為基本的微量元素之一，在肉雞生長、免疫系統發育等方面具有重要作用。Jose等[44]嘗試通過卵內注射不同種類的鋅來達到提前補充鋅元素的目的，發現向卵內注射0.50 mg、0.25 mg納米鋅或0.5 mg蛋氨酸鋅會導致雞胚死亡，但卵內注射0.08 mg或0.04 mg的納米鋅可以使雞胚孵化率提高到80%。Sun等[45]發現，給由缺鋅的母雞產下的受精蛋卵內注射鋅，可以提高雞胚的孵化率，提高破殼后雛雞的健康率，且有機鋅比無機鋅的效果更好。據報道，卵內注射鋅可以促進細胞介導的免疫基因的表達[46]，其可能是提高破殼后雛雞健康率的原因之一。

4.3 硒

硒是一種必需的非金屬微量元素，可調節人類和動物免疫和抗氧化系統等生理功能。硒缺乏會提高機體對傳染病的易感性，并利于病原體定殖，增強應激反應。Lee等[47]發現，對第18胚齡的雞胚卵內注射硒，可以顯著降低壞死性腸炎對肉雞體重的影響，減輕腸道損傷，并且有利于提高患壞死性腸炎雛雞的免疫和抗氧化能力，對壞死性腸炎所致機體損傷起到保護作用。Mahmoud[48]發現，卵內注射乳桿菌與納米硒可以提高雛雞血清過氧化氫酶（CAT）、GSH-Px和SOD的活性，有利于提高肉雞的免疫能力和抗氧化能力。卵內注射卵磷脂硒可以通過調控肉雞促炎和抗氧化基因的表達及其下游通路來增強對雞壞死性腸炎的保護作用[49]。

5 雞胚卵內注射益生菌

益生菌具有增強雛雞免疫力、提高生長性能等功能，近幾年才被用于雞胚卵內注射。在雛雞孵化前，蛋內是無菌環境，雛雞出生后與外界環境接觸后，益生菌才定植和繁殖，建立腸道微生態環境。建立菌群生態平衡前，雛雞易感染致病菌。卵內注射益生菌，可使雛雞在胚蛋時期實現益生菌群的初步構建，進而促進雛雞生長和提高機體免疫力[50]。

5.1 雙歧桿菌

雙歧桿菌因可以提高動物飼料轉化率，提高機體非特異性免疫力，而被用于替代生長促進劑。研究發現，卵內注射雙歧桿菌對胚胎的孵化率和污染率沒有影響，是卵內注射益生菌候選菌[51]。El-Moneim等[52]將雙歧桿菌注射至孵育第17 d的雞胚卵黃內，能夠增加雛雞血紅細胞含量，并顯著促進了回腸的發育，提高雛雞日增重和飼料轉化率，對孵化率影響較小。Abdel-Moneim等[53]發現，卵內注射雙歧桿菌可以增加雛雞體內甲狀腺激素的含量，提高肉雞的飼料轉化率，并降低雛雞感染腸道致病菌的風險。

5.2 枯草芽孢桿菌

枯草芽孢桿菌是雞體內重要的益生菌之一。研究發現，將枯草芽孢桿菌注射到羊水中有利于回腸MUC2基因表達，并且有益于腸道內的細菌菌群的構建，但對肉雞的生長性能和免疫反應沒有影響[54]。在最新的研究中，Oladokun等[55]發現，雖然卵內注射枯草芽孢桿菌對肉雞生長性能和腸道穩態沒有影響，但是卵內注射枯草芽孢桿菌可顯著提高肉雞空腸絨毛高度。

6 雞胚卵內注射益生元

益生元一般指一些不被宿主消化吸收的有機物質，其能夠選擇性地促進體內有益菌的代謝和增殖，從而改善宿主健康。常見的益生元主要有：果糖、半乳聚糖和膳食纖維，家禽行業常用的益生元一般是不易消化的寡糖，包括低聚果糖、菊粉、甘露寡糖、低聚木糖、低聚半乳糖和低聚異麥芽糖。益生元可以增強腸黏膜屏障功能[56]，選擇性地刺激腸道內益生菌的數量等[57-58]，從而改善雞的生產性能。目前，常用的卵內注射的益生元是低聚半乳糖和棉籽糖。

6.1 低聚半乳糖

低聚半乳糖具有維持腸黏膜屏障，降低炎癥反應的功能。Slawinska等[59]研究發現，卵內注射低聚半乳糖可以調節腸道菌群來促進腸道健康，可減輕脾臟中熱誘導的免疫和應激相關基因表達，卵內注射低聚半乳糖可有效提高肉雞對環境壓力的適應能力。研究表明，卵內注射低聚半乳糖可以提高盲腸和空腸中細胞因子IL-1β，IL-10和IL-12 p40的表達量，增加盲腸中宿主防御肽（AvBD1和CATHL2）的表達量，并且提高腸道內游離脂肪酸受體的含量，減少十二指腸中的葡萄糖轉運蛋白量，提高十二指腸后腸道的葡萄糖轉運蛋白量，調節肉雞的能量代謝，維持雞腸道內穩態[60-61]。

6.2 棉籽糖

棉籽糖是由半乳糖，葡萄糖和果糖組成的三糖。棉籽糖存在于豆類、卷心菜、抱子甘藍、西蘭花、蘆筍和所有的谷物中。棉籽糖可以被α-半乳糖苷酶（α-GAL）水解為D-半乳糖和蔗糖。Berrocoso等[62]發現，卵內注射棉籽糖可以改善腸道黏膜形態，提高小腸免疫力。Stadnicka等[63]通過對孵育第12 d雞胚注射棉籽糖，研究發現卵內注射棉籽糖可以提高腸道微絨毛表面積并減少梭狀芽孢桿菌和減少球菌數而更好地抵抗條件性致病菌。近5年，卵內注射益生元的研究越來越多，卵內注射益生元領域是重要的研究方向，該方向具有巨大潛力。

7 雞胚卵內注射合生元

合生元主要是指益生元與益生菌復合物，這種復合產物通過選擇性地刺激有益菌的生長和/或激活其代謝，改善膳食補充劑中微生物的存活和其在胃腸道中的定植[64]。雞胚卵內注射不同組合的合生元可以促進雞的生長，提高雞肉品質。Dankowiakowska等[65]發現，使用菊粉和乳酸桿菌混合的合生元進行卵內注射可以提高肉雞重量，并使得雞胸肌中糖酵解纖維的百分比顯著增加。Dunislawska等[66]發現，卵內注射菊粉和乳酸桿菌可以提高能量代謝和免疫反應相關基因的表達量。Maiorano等[67]發現，使用雙歧桿菌消化的牛奶乳糖中的非消化性反式低聚半乳糖Bi2tos進行卵內注射可以使得肉雞體重顯著增加，胸肌產量顯著增加。

8 結論

隨著我國飼料全面禁抗政策的執行，通過雞胚注射疫苗提高雛雞免疫力、抗病力和生產性能具有良好的發展前景和市場需求。通過雞胚注射疫苗能夠誘導機體快速產生免疫應答反應，減少流行性疾病導致的經濟損失。