探討血清學檢測對羊布魯氏菌病診斷的有效性

余海軍，羅代兵，楊祎祎，田新平*

（1.碧江區農業農村局畜牧水產中心，貴州銅仁554300；2.天津農學院水產學院，天津市水生生態及養殖重點實驗室，天津300384）

羊布魯氏菌病（簡稱羊布病）是一種以布魯氏菌為致病菌引起的人羊共患的傳染性疾病[1]，其病菌對外部環境有較強的適應力、耐低溫、耐干燥，能夠長期生存于動物、水及土壤中。布魯氏菌寄生在動物的細胞中，藥物防控無效，發生流行后，不進行治療，立即撲殺，無害化處理[2]。羊布病被世界動物衛生組織（OIE）列為B類動物疫病，在國內被列為二類動物疫病[3]，不僅對養羊產業發展造成極大影響，也對人畜造成不可低估的危害。目前，對羊布病常使用的實驗室診斷方法為血清學檢測，包括虎紅平板凝集（RBT）、試管凝集（SAT）、膠體金免疫層析和酶聯免疫吸附試驗。本研究基于虎紅平板凝集試驗初篩定性、試管凝集和酶聯免疫吸附試驗復檢定量，對御諾乳業奶山羊場438份樣本進行血清學分析研究，探究其對于羊布病檢測的有效性，為及時了解和掌握羊布病的疫情動態、做好羊布病有效防控措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究在貴州省銅仁市碧江區御諾乳業奶山羊場采集羊血液樣本，將采集的438份樣本分別標號（A1-A81、B1-B112、C1-C56、C61-C98、D1-D151）放置于37℃恒溫培養箱中隔夜培養，待其分離血清，用于后續的血清學研究。

1.2 血清學檢測方法

1.2.1 虎紅平板凝集試驗

取30μL虎紅平板凝集抗原于檢查卡上，分別與等體積的受檢血清和標準陽性血清混勻，室溫靜置5 min，觀察結果。

1.2.2 試管凝集試驗

本研究采用微量法對虎紅平板凝集試驗篩選出的陽性樣本，按照《動物布魯氏菌病診斷技術》（GB/T 18646—2018）操作測定[4]。第一步將受檢血清和抗原對照在U型板中稀釋，每份血清有4孔；第二步將稀釋的抗原100μL加入第一步稀釋好的血清中，稀釋度為1∶25、1∶50、1∶75、1∶100；第三步將試驗組和對照組充分混勻后，放于37℃恒溫培養箱中培養24 h，室溫放置2 h，觀察結果。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗

本研究選用競爭性ELISA抗體檢測試驗對虎紅平板凝集試驗篩選出的陽性樣本進行檢測，具體步驟按照試劑盒說明書操作，最后使用酶標儀對受檢血清、標準陽性、陰性血清進行OD值的測定。

1.3 結果判定

虎紅平板凝集試驗根據檢查卡中出現不同程度的顆粒狀或玫瑰花瓣狀凝集，判定為標準陽性血清，而標準陰性血清無變化。

試管凝集試驗根據受檢血清出現1孔凝集物呈傘狀均勻鋪于孔底，2~4孔孔底均呈現白色點狀凝集，判定為可疑；受檢血清出現1、2孔凝集物呈傘狀均勻鋪于孔底，3、4孔孔底呈現白色點狀凝集，判定為陽性；受檢血清出現1~4孔孔底均呈現白色點狀，判定為陰性。

競爭性ELISA抗體檢測試驗結果根據酶標儀測定450 nm波長處的OD值，按照以下公式計算數據以判定結果。

式中：ODNC為陰性血清的平均OD值；ODPC為陽性血清的平均OD值；ODS為受檢血清的OD值；當ODNC>0.5，且陽性血清抑制率>60%時，試驗結果有效，否則重新試驗；當樣本抑制率≥50%判定為陽性，否則為陰性。

2 結果與分析

2.1 虎紅平板凝集試驗結果（見圖1）

在布病血清學檢測研究中，虎紅平板凝集試驗操作簡單、耗時短，由于其敏感性高、特異性低，因而被廣泛用于布病的初篩[5-7]。由圖1可知，本試驗438份羊血清，虎紅平板凝集試驗初篩147份陽性，291份陰性。

2.2 試管凝集試驗結果（見圖2）

試管凝集試驗對初篩的147份陽性樣品進行復核。由圖2可知，A14、B37、C72、D65、D75、D76、D80、D90、D93、D116為陰性，D131為可疑，其余136份均為陽性。

2.3 競爭性ELISA抗體檢測試驗結果（見圖3）

對147份初篩陽性血清進行競爭性ELISA抗體檢測試驗。由圖3可知，ODNC為0.825 5，陽性血清抑制率為89.30%（0.737/0.825 5），判定試驗結果有效，樣本抑制率約為0.413（即樣本OD值≤0.413為陽性，反之為陰性）；通過復核篩選出136份陽性，11份陰性。

3 討論

羊布病嚴重影響羊養殖產業發展，因此針對布病的診斷和綜合防控，有利于保障養殖產業的經濟效益[8]。目前，布病的診斷檢測存在著2種方法，即血清學檢測和病原學檢測。病原學是通過從疑似患病羊組織、乳汁、分泌物中分離出菌落，涂片染色鏡檢，根據菌落顏色診斷[9-10]；但由于此方法周期長、操作技術和實驗室設備要求高、試驗人員存在感染風險，不能廣泛推廣應用[11-12]。血清學檢測是通過從疑似患病羊血液中分離血清，與抗原試劑混合反應，根據理化反應現象和試驗儀器數據讀取診斷。對比病原學檢測，血清學檢測周期短、試驗儀器要求不高、降低試驗人員的感染風險。因此，在國內外均采用血清學試驗檢測布病[13]。

本研究采用血清學檢測對羊布病進行診斷，通過虎紅平板凝集對438份樣本初篩，試管凝集和競爭性ELISA抗體檢測對初篩的陽性樣本進行復核。結果表明，虎紅平板初篩出147份陽性樣本，試管凝集復核陽性樣本有136份、可疑1份；競爭性ELISA抗體檢測復核有136份，診斷率達92.5%，在一定程度上證明血清學檢測對于羊布病診斷具有有效性。同時，在血清學分析中發現，D131樣本ELISA抗體檢測結果為0.470，大于樣本抑制率，故可以診斷為陰性樣本；而試管凝集結果顯示其屬于可疑樣本，無法診斷其陰、陽性，對照虎紅平板結果也無法診斷，結果見圖4。基于以上結果，可以推斷出在布病陽性樣本復核中，競爭性ELISA抗體檢測靈敏度高于試管凝集檢測，與齊景文等[14]提出的觀點一致，即ELISA抗體檢測用于羊布病復核較為理想。

由于缺乏基礎研究，對于羊布病缺乏準確的診斷手段，同時也嚴重阻礙與之相關的凈化研究和發展。羊布病研究工作者任重道遠，還有大量的基礎研究任務需要完成。因此，需要更多的研究人員參與研究，為動物科學、農業科學和環境科學等學科提供有效且可信的科研資料，為布病深入研究提供參考。

4 結論

本研究通過血清學檢測對貴州碧江地區所采集的438份羊血清進行分析，運用虎紅平板試驗初篩出147份陽性，試管凝集和競爭性ELISA抗體檢測對初篩的147份陽性進行復核得136份陽性，表明92.5%的樣本能診斷為陽性，證明血清學檢測能有效診斷羊布病。