SH2B1通過活化PI3K/Akt通路促進膠質瘤細胞增殖

劉 巖 韓風偉 閆麗娜 張琳娜 王淮興

（承德醫學院附屬醫院神經外科，承德067000）

膠質瘤源自腦神經上皮細胞惡性病變，是最為常見的原發性顱內腫瘤，占顱腦腫瘤的40%～50%［1-2］。3-磷酸肌醇激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白質絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（protein-ser‐ine-threonine kinase，Akt）作為經典的信號通路，在膠質瘤發生發展中起重要作用［3］。SH2B1是SH2B家族成員，是一類含有SH2和PH結構域的信號接頭蛋白，在機體生長發育、免疫調節、增強神經因子誘導方面發揮調控作用［4-5］。近年來研究顯示，SH2B1基因在食管癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤組織中高表達，提示其可能與癌癥發生有關［6-7］。但有關SH2B1在膠質瘤中的表達尚未有研究，因此本研究以膠質瘤U87細胞為研究對象，利用siRNA干擾技術沉默SH2B1基因表達，觀察U87細胞增殖、凋亡及PI3K/Akt通路的改變，旨在為SH2B1在膠質瘤發生發展中的效應機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦星形膠質母細胞瘤U87細胞（CCY1528）購自上海酶研生物科技有限公司。10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素、胰酶、RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；Trizol抽提試劑、逆轉錄試劑盒、BCA試劑盒購自BioRad公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；SH2B1-siRNA、NC-siR‐NA購自南京銳真生物技術有限公司；CCK8相關試劑購自美國Sigma公司；鼠源一抗SH2B1、Ki67、PC‐NA、Bax、Bcl-2、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、GAPDH、羊抗鼠二抗購自上海圣克魯斯生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 U87細胞培養基為含100 U/ml青霉素-鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI1640培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.2.2 細胞轉染 收集對數生長期的細胞以2.0×105個/孔接種于24孔細胞板，利用Lipofectamine 2000轉染法轉染膠質瘤U87細胞，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。實驗分為3組：SH2B1-siRNA轉染組（正義 鏈5′-GCCGGUCAUGUCCAAAGUATT-3′，反義鏈5′-UACUUUGGACAUGACCGGCTT-3′）；NC-siRNA組（正義鏈5′-GATCCGGACCACCGCATCTCT-3′，反義鏈5′-GCCTGGTGGCGTAGAGATGTA-3′）和未經處理的膠質瘤U87細胞為空白組。轉染48 h后收集各組轉染成功的細胞，提取總RNA及總蛋白供后續研究使用。

1.2.3 qRT-PCR檢測SH2B1 mRNA表達 收集1.2.2中各組U87細胞，提取總RNA，利用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，通過逆轉錄buffer 2μl，上游引物0.2μl，下游引物0.2μl，dNTP 0.1μl，逆轉錄酶0.5μl，DEPCS水2μl，總體積為10μl的反應體系得到cRNA。后利用qRT-PCR試劑盒檢測各組細胞中SH2B1 mRNA表達情況。以GAPDH為內參基因，反應條件如下：94℃預處理30 s，59.5℃30 s，72℃1 min，72℃5 min，以上3步驟循環40次。引物序列見表1。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖 收集1.2.2中各組U87細胞以2×104個/孔接種于96孔板，每組設置6個復孔，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養24 h、48 h、72 h后，每孔加入10μl濃度為1.5 mg/ml的CCK-8，繼續培養4 h，讀取吸光度值（A），測定時以未接種細胞只加培養基孔的A值為空白對照調零。

1.2.5 平板克隆法檢測細胞增殖 收集1.2.2中各組U87細胞，胰蛋白酶消化、重懸，梯度稀釋后接種至含RPMI1640培養基的培養皿中（1 000個/皿），移液器吹打分散均勻，置于培養箱常規培養，待出現肉眼可見克隆后，棄去上清，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，0.5%結晶紫染色，20 min后，清洗染色液，空氣干燥。計數3組細胞克隆形成數。

1.2.6 細胞凋亡情況檢測 收集1.2.2中各組U87細胞，胰蛋白酶消化，預冷PBS洗滌2次，離心棄上清，配制成1×106個/ml的細胞懸液，100μl細胞懸液加入5μl AnnexinV‐FITC和5μl PI混勻，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測凋亡率。實驗重復3次。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達情況 收集1.2.2中各組U87細胞，提取總蛋白，通過BCA蛋白試劑盒檢測細胞中總蛋白含量，蛋白總上樣量為60μg，10%SDS-PAGE分離蛋白，轉移蛋白至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。封閉完成后加入適宜 濃 度SH2B1、Ki67、PCNA、Bax、Bcl-2、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt一抗，4℃封閉過夜，24 h后吸取一抗，清洗PVDF膜后，加入相應二抗（山羊抗鼠）37℃封閉1 h，滴加ECL顯色液，用凝膠成像系統獲取蛋白條帶圖片，用Tanon 600圖像分析系統拍照，對蛋白質表達量進行定量分析，以GAPDH為內參。

1.3 統計學分析 采用統計學軟件SPSS22.0進行數據分析，計量資料符合正態分布的數據以±s表示，多組間比較行方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 si-SH2B1抑制SH2B1表達 與空白組相比，NC-siRNA組SH2B1 mRNA及SH2B1蛋白表達差異均無統計學意義（P＞0.05），SH2B1-siRNA組SH2B1 mRNA及SH2B1蛋白表達顯著降低（P＜0.05，圖1）。

2.2 s i-SH2B1抑制U87細胞增殖 CCK-8實驗顯示，與空白組相比，SH2B1 siRNA組48 h、72 h后OD值顯著降低（P＜0.05）；與NC-siRNA組相比，SH2B1siRNA組轉染后48 h、72 h后OD值顯著降低（P＜0.05）。而空白組與NC-siRNA組各時間點OD值差異無統計學意義（P＞0.05，圖2）。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

2.3 si-SH2B1抑制U87細胞平板克隆形成數 與空白組相比，SH2B1-siRNA組克隆形成個數顯著降低（P＜0.05）；與NC-siRNA組相比，SH2B1-siRNA組克隆形成個數顯著降低（P＜0.05）（圖3、4）。而空白組與NC-siRNA組克隆形成個數差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 si-SH2B1促進U87細胞凋亡 與空白組相比，SH2B1-siRNA組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與NC-siRNA組相比，SH2B1-siRNA組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05，圖5、6）。空白組與NC-siRNA組細胞凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組U87細胞中SH2B1 mRNA及蛋白表達情況Fig.1 Expression of SH2B1 mRNA and protein in U87 cells of each group

圖2 各組不同時間增殖情況比較Fig.2 Comparison of proliferation in each group at differ?ent time

圖3 平板克隆法檢測各組U87細胞增殖情況Fig.3 Proliferation of U87 cells in each group was detect?ed by plate cloning method

2.5 si-SH2B1抑制Ki67、PCNA、Bcl-2蛋白表達，促進Bax蛋白表達 與空白組相比，SH2B1-siRNA組Ki67、PCNA、Bcl-2蛋白表達顯著降低（P＜0.05），Bax蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與NC-siRNA組相比，SH2B1-siRNA組Ki67、PCNA、Bcl-2蛋白表達顯著降低（P＜0.05），Bax蛋白表達顯著升高（P＜0.05，圖7）。空白組與NC-siRNA組Ki67、PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.6 si-SH2B1抑制p-PI3K/PI3K、p-Ak/tAkt表達與空白組相比，SH2B1-siRNA組p-PI3K/PI3K、p-Ak/tAkt表達顯著降低（P＜0.05）；與NC-siRNA組相比，SH2B1-siRNA組p-PI3K/PI3K、p-Ak/tAkt表達顯著降低（P＜0.05，圖8）。空白組和NC-siRNA組p-PI3K/PI3K、p-Ak/tAkt表達差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 各組U87細胞克隆形成數比較Fig.4 Comparison of number of U87 cell clone formation in each group

圖5 各組U87細胞凋亡率比較Fig.5 Comparison of apoptosis rate of U87 cells in each group

圖6 各組U87細胞凋亡率比較Fig.6 Comparison of apoptosis rate of U87 cells in each group

圖7 各組U87細胞增殖、凋亡相關蛋白表達情況Fig.7 Expression of proliferation and apoptosis related proteins in U87 cells of each group

圖8 各組PI3K/AKT通路相關蛋白表達情況Fig.8 Expression of PI3K/Akt pathway related proteins in each group

3 討論

SH2B1作為SH2B家族新成員，含有SH2與PH結構域的信號接頭蛋白，在生長發育、代謝平衡等方面發揮重要調節作用［8］。SH2B1是酪氨酸激酶受體A與細胞膜相連的結合蛋白，主要介導含酪氨酸磷酸化的信號轉導途徑，存在于下丘腦、肝臟、脂肪等多種組織及細胞中［9］。關于SH2B1的研究多集中在糖尿病及肥胖癥中，SH2B1參與胰島素敏感性及血糖平衡的調節，且可調節能量代謝及體重［10］。研究顯示，SH2B1參與神經生長因子誘導的神經分化，猜測SH2B1在顱腦疾病中發揮作用［11］。SH2B1在非小細胞肺癌等惡性腫瘤中高表達，且發揮促癌基 因 的 作 用［6，12］。 本 研 究 采 用siRNA靶 向 沉 默SH2B1基因表達策略，探討SH2B1在膠質瘤細胞中的效應及可能機制。

惡性腫瘤的發生發展與腫瘤細胞增殖、凋亡失衡有關［13］。細胞增殖及細胞凋亡均是由一系列基因級聯控制的過程［14］。本研究中，與空白組及NC-siRNA比較，SH2B1-siRNA組U87細胞轉染48 h、72 h U87細胞增殖率、克隆形成數顯著降低，凋亡率顯著升高，提示沉默SH2B1基因表達可抑制U87細胞增殖，促進U87細胞凋亡，表明SH2B1通過影響腫瘤細胞增殖、凋亡參與膠質瘤發生發展。Ki67及PCNA與細胞增殖密切相關，Ki67是增殖相關的核抗原，與細胞有絲分裂密切相關，在細胞增殖過程中必不可少［15］；PCNA只存在于正常增殖細胞及腫瘤細胞內，與細胞DNA合成密切相關，是細胞異常增殖的關鍵蛋白［16］。Bax、Bcl-2具有同源性，均屬于Bcl-2基因家族，Bax主要發揮促凋亡作用，Bcl-2發揮抑制凋亡作用［17］。本研究中，與空白組及NC-siR‐NA組相比，SH2B1-siRNA組U87細胞Ki67、PCNA、Bcl-2蛋白表達顯著降低，Bax蛋白表達顯著升高，進一步提示沉默SH2B1表達可抑制U87細胞增殖，促進U87細胞凋亡。

研究表明，PI3K/Akt信號通路在肝癌、乳腺癌等多種腫瘤中失調，主要表現為PI3K及Akt過度活化［18-19］。PI3K含有p85和p110兩部分，其中p85羧基端有SH2結構域，p85與p110在SH2區結合，Akt是PI3K/Akt信號轉導通路的中樞，其活化與腫瘤惡性進展有關［15］。Akt共含有3個亞基：N端的PH結構域、中間的激酶/催化結構域、C端的調節結構域，其中PH結構域可介導Akt進行膜轉位，進而激活Akt。PI3K可通過激活下游靶點Akt，通過磷酸化作用使其轉化為p-Akt，進而激活或抑制下游基因表達，介導細胞增殖、凋亡。LU等［20］研究顯示，SH2B1過表達可通過激活PI3K/Akt信號通路活化降低海馬神經元細胞凋亡。另有研究顯示，Akt磷酸化可調控Bax、Bcl-2表達發揮抗凋亡作用［21］。在本研究中，與空白組及NC-siRNA組相比，SH2B1-siRNA組p-PI3K/PI3K、p-Ak/tAkt表達顯著下降，提示沉默SH2B1基因可能通過抑制PI3K/Akt信號通路活化，從而抑制U87細胞增殖、促進細胞凋亡。

該研究為膠質瘤的靶向治療提供了新思路，但本研究也存在一定不足，膠質瘤細胞增殖、凋亡由多基因、多通路共同調控，是十分復雜的網絡結構，其具體機制有待進一步研究。