川芎嗪通過JAK 2/STAT3信號通路調(diào)節(jié)線粒體自噬減輕心肌缺血再灌注損傷的機制研究

陳乘波 陳天寶 許友榜 （福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院心內(nèi)科，泉州362000）

心肌缺血是心臟性猝死的主要原因之一，冠狀動脈再灌注是治療缺血性疾病最有效的方法，但其可能加重細(xì)胞損傷，即缺血再灌注損傷。由于心肌細(xì)胞無法再生，減少心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的策略受到了廣泛關(guān)注［1］。目前，心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的防治主要包括通過腺苷與別嘌呤醇減少炎癥反應(yīng)、阿托伐他汀鈣降低TNF-α、IL-1β濃度與心肌細(xì)胞凋亡及心肌缺血預(yù)處理等［2］。心肌再灌注期由于血氧的突然再補給而伴隨活性氧（reactive oxy‐gen species，ROS）的積累。線粒體不僅是心肌細(xì)胞產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵細(xì)胞器，也是ROS的主要來源和靶點。ROS可通過過氧化氫離子氧化細(xì)胞膜和細(xì)胞器脂質(zhì)，這種脂質(zhì)過氧化進一步導(dǎo)致反應(yīng)性醛的增加，進而導(dǎo)致線粒體損傷。內(nèi)源性酪氨酸激酶2（ja‐nus kinase signal transducers 2，JAK2）是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduc‐ers and activators of transcription 3，STAT3）為其受體，JAK2與STAT3結(jié)合后可啟動目的基因表達，促進多種生長因子表達，減少細(xì)胞凋亡［3］。AG490為JAK2激酶的有效抑制劑，可抑制JAK2/STAT3信號通路的激活［4］。川芎嗪是從中藥傘形科植物川芎提取出的四甲基吡嗪有效成分，具有抗血小板聚集、擴張血管等作用，臨床常用于心腦血管疾病的治療，但對于心肌缺血再灌注損傷的保護作用與機制鮮有報道［5］。本研究采用川芎嗪治療心肌缺血再灌注損傷，闡明其保護作用并對可能的機制進行探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與試劑 SD雄性大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，體重200～220 g，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2017-0011。戊巴比妥鈉、肝素鈉購自北京索萊寶科技有限公司；AG490、TTC、DAPI購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；Bcl2、Bax、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）及β-actin一級抗體購自細(xì)胞信號技術(shù)有限公司；抗JAK2、STAT3一級抗體購自圣克魯斯生物技術(shù)公司；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）購自中山公司；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記（TdT-mediated dUTP nick labeling，TUNEL）染色試劑盒購自羅氏公司。

1.1.2 主要儀器 Langendorff小動物心臟灌注裝置購自安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，Leica RM2135組織切片機購自德國Leica公司；LIOOS600T熒光顯微鏡購自日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 動物造模及分組 SD大鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg），腹腔注射500 U/kg肝素鈉20 min后，仰臥位固定于無菌操作臺。采用冠狀動脈結(jié)扎術(shù)建立缺血再灌注模型，將左上肢、右上肢和左下肢接針形電極，用以記錄大鼠心電圖（elec‐trocardiogram，ECG）和心率（heart rate，HR）；于氣管處行縱切口，插管連接動物呼吸機。同時參照文獻［9］采用6-0線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，穩(wěn)定10 min后，收緊線結(jié)即造成左冠狀動脈閉塞以致大鼠心肌缺血，由左冠狀動脈所支配的局部心肌發(fā)紺，心臟局部搏動受限，血壓下降，ECG顯示ST段波動較大或抬高或降低，呈現(xiàn)心肌梗死改變，視為大鼠心臟缺血成功，缺血30 min后再灌注60 min，以心電圖ST抬高≥0.15 mV為結(jié)扎成功的標(biāo)準(zhǔn)，松開線結(jié)后ST-T回落超過50%為再灌注成功的標(biāo)志。造模成功后將大鼠隨機分為：對照組（IR組）、川芎嗪治療組（Lig組）、川芎嗪治療且AG490處理組（Lig-AG組）及AG490處理組（AG組），15只/組。Lig組造模前灌胃3 mg/L川芎嗪；Lig-AG組灌胃3 mg/L川芎嗪且含有5 mg/L的AG490；AG組灌胃5 mg/L的AG490；給藥體積5 ml，IR組給予等體積生理鹽水。

1.2.2 LVDP、HR、±dp/dtmax及CF的檢測 心臟缺血再灌注結(jié)束后，通過傳感器（Biopac System）檢測各組大鼠LVDP、HR及CF，該傳感器與通過左心房插入左心室的注水乳膠球囊相連。心肌功能指數(shù)由左室舒張壓和最大壓力變化率（+dp/dtmax）決定。在實驗開始時，通過充氣使LVEDP調(diào)整到大約5 mmHg。隔離的心臟被恒溫玻璃罩（37℃）包圍以保持溫度。所有數(shù)據(jù)均采用AcqKnowledge 3.8.1軟件包和Biopac數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)進行記錄和存儲。

1.2.3 心肌梗死面積檢測 心功能檢測結(jié)束后，迅速剝離大鼠心臟，并沿長軸連續(xù)切成6片。在37℃、1%TTC孵育10 min后，分別稱重6個心肌切片。計算機輔助平面測量法（OPTIMASv5.2）評估梗死區(qū)域的年齡百分比。標(biāo)準(zhǔn)化梗死面積（%）=梗死面積/總危險面積×100%。

1.2.4 心肌細(xì)胞凋亡檢測 TUNEL染色檢測心肌細(xì)胞凋亡水平。采用雙染色法，TUNEL染色定量凋亡核，DAPI染色定量心肌細(xì)胞核總數(shù)。在400倍放大條件下，隨機選取5個區(qū)域，對綠色染色的TUNEL陽性細(xì)胞和所有藍色DAPI染色的細(xì)胞進行計數(shù)。細(xì)胞凋亡指數(shù)（%）=總陽性凋亡心肌細(xì)胞/總肌細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 線粒體膜電位檢測 采用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）染色，熒光顯微鏡觀察拍照。自噬細(xì)胞經(jīng)JC-1染色后觀察應(yīng)顯示綠色熒光，正常細(xì)胞經(jīng)JC-1染色后應(yīng)顯示紅色熒光，常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的檢測指標(biāo)之一，熒光定量采用Image J軟件。

1.2.6 氧化應(yīng)激水平檢測 取部分大鼠心臟組織，試劑盒測定SOD活性和H2O2、MDA、GSH、GSSG水平。GSH和GSSG的值用于使用能斯特方程計算線粒體氧化還原電位（Eh）。

圖1 Lig對缺血再灌注心臟功能損傷的影響Fig.1 Effect of Lig on ischemia reperfusion injury

圖2 Lig對大鼠心臟梗死體積的影響Fig.2 Effect of Lig on the volume of heart infarction in rats

1.2.7 Western blot 提取心肌組織總蛋白并定量。在蛋白樣品中加入上樣緩沖液，95℃或更高溫度下變性10 min。將樣品加入SDSPAGE膠樣品孔（80 V，2 h）。膜轉(zhuǎn)移后（90 V，60 min），2%BSA密封過夜。TBST清洗4次后，4℃下一級抗體孵育過夜。TBST清洗4次，37℃下二級抗體孵育1 h。TBST清洗4次，反應(yīng)30 s后，將顯影液加入成像系統(tǒng)進行曝光和圖像采集，并以β-actin作為內(nèi)參蛋白計算蛋白相對表達量。

汽輪機整個啟動過程就是一個緩慢均勻的加熱過程，各部溫差及膨脹不正常的情況下就容易發(fā)生碰磨產(chǎn)生振動，升速率及暖機點的選擇和控制就至關(guān)重要。本次汽封更換間隙調(diào)整后，除臨界轉(zhuǎn)速區(qū)以外，升速率及機組帶負(fù)荷速度均應(yīng)比正常啟動緩慢，以便汽輪機加熱和汽封磨合，通過脹差、汽缸膨脹、各部溫度綜合判斷暖機效果及汽封磨合狀況，再決定升速或加負(fù)荷，切忌單純憑時間或某一參數(shù)決定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS16.0軟件，作圖工具采用Graphpad5.01軟件，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LVDP、HR、±dp/dtmax及CF的比較 如圖1所示，與IR組相比，Lig組LVDP、HR、+dp/dtmax和CF明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與Lig組相比，Lig-AG組、AG組LVDP、HR、+dp/dtmax和CF明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 大鼠離體心臟梗死面積比較 如圖2所示，TCC染色結(jié)果顯示，與IR組相比，Lig組心肌梗死面積明顯減小，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與Lig組相比，Lig-AG組、AG組心肌梗死面積明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 Lig對缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡的影響（×400）Fig.3 Effect on myocardial cell apoptosis after ischemia reperfusion（×400）

圖4 Lig對缺血再灌注后線粒體膜電位的影響Fig.4 Influence of Lig on mitochondrial membrane poten?tial after ischemia reperfusion

2.3 心肌細(xì)胞凋亡比較 如圖3所示，與IR組相比，Lig組細(xì)胞凋亡率明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與Lig組相比，Lig-AG組、AG組細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 線粒體膜電位比較 如圖4所示，與IR組相比，Lig組線粒體膜電位明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與Lig組相比，Lig-AG組、AG組線粒體膜電位明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 Lig對缺血再灌注后氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of Lig on oxidative stress response after isch?emia reperfusion

圖6 Lig對缺血再灌注后JAK2/STAT3通路及Bcl2、Bax蛋白表達的影響Fig.6 Effects of Lig on JAK 2/STAT3 pathway，Bcl2 and Bax protein expression after ischemia reperfusion

2.6 JAK2、STAT3、Bcl2、Bax的表達 如圖6所示，與IR組相比，Lig組JAK2、STAT3、Bcl2蛋白表達明顯升高，Bax蛋白表達明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與Lig組相比，Lig-AG組、AG組JAK2、STAT3、Bcl2蛋白表達明顯降低，Bax表達明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

缺血性心臟病是臨床常見心血管系統(tǒng)疾病之一，實行冠狀動脈再灌注可有效降低死亡率［6］。然而，在短時間內(nèi)中斷心肌供血，一定時間后恢復(fù)供血，原缺血心肌會發(fā)生較為嚴(yán)重的損傷，包括心肌功能異常和細(xì)胞死亡等，這種情況稱為心肌再灌注損傷［7］。通常認(rèn)為，再灌注時自由基爆發(fā)、細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡等是缺血再灌注損傷的重要原因［8］。

細(xì)胞通過自噬機制來清除受損或不需要的線粒體稱為線粒體自噬，發(fā)生缺血再灌注損傷時，線粒體可產(chǎn)生大量ROS，且線粒體通透性發(fā)生改變，從而誘發(fā)線粒體自噬，線粒體通過細(xì)胞的自噬機制被清除［9-10］。另外，MDA是自由基引起不飽和脂肪過氧化作用的特征產(chǎn)物，心肌缺血再灌注損傷時，線粒體內(nèi)MDA含量顯著升高［11-12］。同時，GSH是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的多肽，研究表明，GSH預(yù)處理可減少線粒體氧化應(yīng)激，減少缺血再灌注損傷［13-14］。因此，缺血再灌注導(dǎo)致的線粒體能量障礙是細(xì)胞壞死和凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

川芎嗪對心血管病的治療具有顯著療效，其作用機制主要有清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、促進心肌細(xì)胞能量代謝、調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達、影響細(xì)胞因子等。熊響清等［15］研究表明，川芎嗪可以和參麥注射液協(xié)同作用治療腦缺血再灌注損傷，緩解大鼠大腦缺血再灌注與多器官損傷；彭淼云等［16］研究表明當(dāng)川芎嗪與地塞米松聯(lián)合用藥時，用于治療腎缺血再灌注損傷，可能通過誘導(dǎo)Bcl2蛋白的合成，下調(diào)c-Fos、ICAM-1蛋白的合成減輕腎損傷；有研究表明，川芎嗪能夠平衡eNOS/iNOS兩種蛋白表達，維持體內(nèi)NO正常濃度以防止過量NO造成的心肌組織損傷［17-18］。李鵬飛等［19］研究表明，川芎嗪作用于缺血再灌注的大腦時還可減少線粒體損傷。然而，川芎嗪對于心肌缺血再灌注損傷的保護與機制的研究鮮有報道。實驗結(jié)果表明，川芎嗪能夠顯著減小心肌梗死面積、改善心肌功能、減少心肌細(xì)胞凋亡，可對缺血再灌注后的心肌細(xì)胞產(chǎn)生明顯保護作用。且川芎嗪能夠抑制線粒體膜電位降低，抑制線粒體內(nèi)MDA表達、GSH/GSSG升高并促進SOD表達，提高缺血再灌注后心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體的氧化應(yīng)激，進而抑制線粒體自噬，最終緩解缺血再灌注對于心肌細(xì)胞的損傷。

JAK2/STAT3信號通路是參與機體分化、代謝、血管再生與侵襲的重要信號通路，多種因子及藥物可通過激活此通路促進細(xì)胞新生，改善缺血，參與心肌保護［20］。Bcl2蛋白質(zhì)家族可在線粒體水平上決定細(xì)胞的存活或死亡，定位于細(xì)胞內(nèi)膜系特別是線粒體外膜上的Bcl2可起抗凋亡作用［21-22］。Bax作為促凋亡因子可活化轉(zhuǎn)移至線粒體外膜形成蛋白性孔道，改變線粒體膜通透性，激活下游caspase-9而誘導(dǎo)凋亡起始［23］。實驗結(jié)果表明，川芎嗪能夠促進JAK2/STAT3信號通路的激活與Bcl2的表達，同時抑制Bax表達。因此，川芎嗪可通過對JAK2/STAT3信號通路的激活促進心肌細(xì)胞的保護作用，并可通過調(diào)節(jié)Bcl2與Bax表達抑制心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，JAK2/STAT3信號通路可能與缺血再灌注后的細(xì)胞凋亡相關(guān)，通過川芎嗪治療可緩解缺血再灌注后心肌細(xì)胞的損傷。川芎嗪對于心肌缺血再灌注損傷的保護作用可能是通過對JAK2/STAT3信號通路及線粒體自噬的調(diào)控實現(xiàn)的。