疏肝清熱通絡方對糖尿病大鼠脂肪酸合成酶及心肌AMPK/ eNOS 信號通路的影響

王坤玲，連 軍，周詩穎，李 林

（1.新疆醫科大學第一附屬醫院中醫科，烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學實驗室與設備管理處動物實驗中心，烏魯木齊 830011；3.新疆醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，烏魯木齊 830011）

2 型糖尿病患者機體血糖水平長期處于異常狀態，常會引起體內血脂代謝異常，誘發或加重機體內多種臟器的炎癥損傷，導致心肌結構及功能受損[1-2]。FAS 是與機體脂肪生成及代謝密切相關的代謝酶，主要分布于肝臟及脂肪組織中，并以在肝臟中表達為主[3]。AMPK/eNOS 信號通路及其相關蛋白水平異常與糖尿病及心肌損傷的發生密切相關[4-5]。疏肝清熱通絡方是以傳統中醫藥理論為指導，治療2 型糖尿病療效顯著[6]，而其對于脂肪酸合成酶及心肌AMPK/eNOS 信號通路的影響目前尚未見報道。本研究觀察疏肝清熱通絡方對于2 型糖尿病大鼠肝臟脂肪酸合成酶及心肌AMPK/eNOS 信號通路的影響，以期為疏肝清熱通絡方對于脂肪代謝及心肌損傷的保護作用研究提供新的參考和依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級成年雄性SD大鼠，6～8周齡，體質量（180±20）g，購于新疆醫科大學實驗動物中心，動物房溫度（22±2）℃，濕度（50±10）%，適應性喂養1 周后進行實驗。

1.2 藥物與試劑 疏肝清熱通絡方（SQT）（柴胡15 g，郁金10 g，黃芩10 g，黃連10 g，大黃10 g，芍藥10 g，當歸6 g，丹參10 g，水蛭10 g）由藥材飲片制成每毫升含1 g 生藥的制劑，購于北京同仁堂股份有限公司（批號：201903282）；鏈脲佐菌素（STZ）購自美國 Sigma 公司（批號：201907131）；SOD 活性檢測試劑盒及MDA 檢測試劑盒，AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS 及GAPDH 抗體購自碧云天生物科技有限公司（貨號：S0103、S0131M、AF1627、AF2677、AF6792、AF5812、AF1186）；磷酸酶抑制劑復合物購自上海生工生物公司（貨號PL107）；糖化血紅蛋白酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號：201812112）。

1.3 主要儀器 DM500 顯微鏡購自德國Leica 公司；AllegraX30R 多功能離心機購自美國Beckman 公司；Multiskan GO 酶標儀購自美國Thermo Fisher 公司；ChemiDoc XRS 型凝膠成像儀購自美國Bio-Rad 公司；ACCU-CHEK Active 血糖儀購自羅氏診斷產品（上海）有限公司。

1.4 造模與分組 除15 只大鼠作為對照組外，其余60 只大鼠參照文獻[7]建立2 型糖尿病模型大鼠。具體方法為：給予大鼠高脂飼料喂養4 周后，根據大鼠體質量按照25 mg/kg 腹腔注射1% STZ，1 周后按照40 mg/kg 再次腹腔注射給予大鼠1% STZ，常規喂養3 d 后自尾靜脈采血，使用血糖儀測定血糖，連續3 d 大鼠血糖濃度均＞16.7 mmol/L 以及尿糖達+++～++++視為2 型糖尿病大鼠模型建立成功。

1.5 實驗給藥 將造模完成后的大鼠按照體質量隨機分為模型組、SQT 低、中、高劑量組，15 只/組。以SQT 的臨床使用劑量為參考，通過劑量換算后[8]，SQT 低、中、高劑量組大鼠分別根據大鼠體質量按照10、20、30 g/kg 的劑量灌胃予大鼠SQT，對照組及模型組灌胃予大鼠等量生理鹽水，每日1 次，連續給藥8 周[9]。最后1 次給藥24 h 后，大鼠禁食不禁水12 h 后，尾靜脈取血后使用血糖儀檢測大鼠空腹血糖水平。

1.6 觀察指標

1.6.1 大鼠糖化血紅蛋白水平測定 大鼠通過眼眶后靜脈叢取血，按照ELISA 試劑盒說明書檢測大鼠糖化血紅蛋白水平。

1.6.2 大鼠血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平測定 取大鼠血清，進樣至全自動生化分析儀，測定大鼠血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平。

1.6.3 大鼠肝組織FAS mRNA水平測定 大鼠處死后分離肝組織，提取總RNA 并逆轉錄成cDNA，定量PCR檢測肝組織FAS mRNA 水平。引物序列為：FAS，正向引物：5′-AGCCCGGCCAGCGATACAGA-3′，反向引物：5′-GGACCACCCGGGCCATAGGT-3′；β-actin，正向引物：5′-AGAGTCGCGAGCTTGATCTT-3′，反向引物：5′-TTGGAATAGGGGACCTCGTG-3′，結果采用2-△△Ct法計算相對表達量。

1.6.4 大鼠心肌組織SOD 活性及MDA 水平測定 取大鼠心肌組織，按照試劑盒說明書檢測心肌組織SOD活性及MDA 水平。

1.6.5 大鼠心肌組織病理學檢查 取心肌組織，在中性甲醛中固定，石蠟包埋，并進行5 μm 切片，按照蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE 染色）步驟進行染色后，使用光學顯微鏡觀察大鼠腎組織病理學變化。

1.6.6 Western blot 檢測大鼠心肌組織AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS 蛋白水平 取大鼠心肌組織加入RIPA 蛋白裂解液及磷酸酶抑制劑，在玻璃勻漿器勻漿，4 ℃，12 000 rpm 離心10 min，取上清液于100 ℃水浴5 min 變性處理，BCA 法測定蛋白濃度后，取50 μg 蛋白進行SDS-PAGE 電泳分離，轉膜。封閉液室溫封閉1 h 后，經AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS 及GAPDH 抗體（1:1 000）4 ℃孵育過夜。PBST 充分洗膜后，加入二抗（1:2 000）室溫條件下再次孵育1 h，PBST 清洗后在蛋白條帶上加入顯色液顯影，并利用凝膠成像儀成像后，應用Image J 軟件進行免疫印跡灰度值定量分析。

1.7 統計學方法 應用SPSS 19.0 對數據進行處理，Graphpad prism 5 繪圖，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，計量資料用均數±標準差（）表示，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平比較 見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平比較（，n =15）

表1 各組大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平比較（，n =15）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與SQT 低劑量組比較，▲P ＜0.05；與SQT 中劑量組比較，□P ＜0.05

2.2 各組大鼠肝組織FAS mRNA 水平比較 見表2。

表2 各組大鼠肝組織FAS mRNA 水平比較（，n =15）

表2 各組大鼠肝組織FAS mRNA 水平比較（，n =15）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與SQT 低劑量組比較，▲P ＜0.05；與SQT 中劑量組比較，□P ＜0.05

2.3 各組大鼠心肌組織SOD 活性及MDA 水平比較 見表3。

表3 各組大鼠心肌組織SOD 活性及MDA 水平比較（，n =15）

表3 各組大鼠心肌組織SOD 活性及MDA 水平比較（，n =15）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與SQT 低劑量組比較，▲P ＜0.05；與SQT 中劑量組比較，□P ＜0.05

2.4 各組大鼠血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平比較 見表4。

表4 各組大鼠血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平比較（，n =15）

表4 各組大鼠血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平比較（，n =15）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與SQT 低劑量組比較，▲P ＜0.05；與SQT 中劑量組比較，□P ＜0.05

2.5 各組大鼠心肌組織病理學檢查結果 與對照組相比，模型組大鼠心肌細胞明顯腫脹，細胞排列不整齊，可見大量炎性細胞浸潤，肌原纖維結構受損嚴重；與模型組相比，SQT 各劑量組大鼠心肌組織病理學明顯改善，SQT 低、中劑量組大鼠心肌組織細胞膜完整，炎性細胞浸潤明顯減輕，肌原纖維結構有所改善，SQT 高劑量組大鼠心肌細胞膜完整，偶見炎性細胞浸潤，肌原纖維結構完整。見圖1。

2.6 各組大鼠心肌組織AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS 蛋白水平測定結果 與對照組相比，模型組大鼠心肌組織AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS、p-eNOS/ eNOS、p-AMPKα1/ AMPKα1 水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，SQT 低、中、高劑量組大鼠心肌組織AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、peNOS、p-eNOS/ eNOS、p-AMPKα1/ AMPKα1 水平均顯著升高（P＜0.05），且隨著SQT 劑量的增加，大鼠心肌組織AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS、peNOS/ eNOS、p-AMPKα1/ AMPKα1 水平逐漸升高。見圖2，圖3。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學檢查結果（HE 染色，×200）

圖2 各組大鼠心肌組織AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS 蛋白水平比較

圖3 各組大鼠心肌組織AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS、p-eNOS 蛋白水平

3 討論

2 型糖尿病是指機體內胰島素作用減弱造成胰島素相對缺乏的狀態，從而引起體內血糖代謝紊亂。糖尿病患者通常伴隨著血脂代謝異常，造成血管平滑肌及內膜引起炎癥損傷，進一步引起冠狀動脈粥樣硬化、心肌損傷等多種心血管疾病。FAS 主要分布在肝臟及脂肪組織中，與脂肪合成密切相關的一種代謝酶，主要參與脂肪酸合成過程中轉酰、縮合、還原、脫水和再還原等關鍵過程[10-11]。

eNOS 是調控血管內皮釋放一氧化氮（NO）的關鍵基因，當eNOS 水平降低時，血管內皮NO 釋放就會減少，導致血管內皮功能紊亂及收縮功能障礙，引起心肌細胞損傷[12]。AMPK 是體內能量代謝的關鍵調節激酶，在控制葡萄糖轉運，脂肪酸氧化和脂質合成等過程中發揮重要作用，并能夠調控eNOS 基因表達，影響NO 水平[13]。

中醫學將糖尿病定義為消渴，中醫理論認為糖尿病的發病機制為肝失調暢、氣機不暢，痰濕不行，血液瘀滯。疏肝清熱通絡方是以柴胡、郁金等多種中藥材組成的成方制劑，柴胡、郁金疏肝解郁，柴胡與芍藥合用則調理肝氣，黃芩、黃連清熱瀉火，當歸、白芍、大黃、丹參、水蛭活血化瘀通絡，全方共奏辛開苦降、調暢氣機、化瘀通絡功效。本研究通過觀察疏肝清熱通絡方（SQT）對2 型糖尿病大鼠肝臟脂肪酸合成酶及心肌AMPK/eNOS 信號通路的影響，因目前臨床中尚未有作用機制明確的，用于治療糖尿病大鼠心肌損傷AMPK/ eNOS 信號通路調節劑，故本實驗未使用陽性對照藥物。本研究結果表明，與模型組相比，SQT 低、中、高劑量組大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平明顯降低，且與SQT 的劑量表現出依賴性，提示疏肝清熱通絡方能夠呈劑量依賴性的降低大鼠血糖水平，影響大鼠體內糖代謝。血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平是反映機體內血脂水平的關鍵指標，肝臟FAS mRNA水平則體現了肝臟脂肪的合成能力，間接反映了機體內血脂的代謝水平。本實驗結果表明，SQT 各劑量組大鼠血清FFA、TG、TC、LDL-C 水平、肝組織FAS mRNA 水平較模型組明顯降低，表明疏肝清熱通絡方能夠通過影響糖尿病大鼠肝臟脂肪酸合成酶的表達水平，進而影響其體內活性，干擾糖尿病大鼠體內脂肪的合成，改善糖脂代謝異常。MDA 水平及SOD 活性是反映組織器官氧化應激水平的常用指標，MDA 水平升高及SOD 活性降低，均能提示機體處于氧化應激損傷狀態及自我修復能力下降。本研究發現，SQT 各劑量大鼠心肌組織MDA 水平明顯降低，SOD活性、AMPKα1、p-AMPKα1、eNOS及p-eNOS蛋白水平較模型組均明顯升高，大鼠心肌組織病理學變化明顯改善，提示疏肝清熱通絡方能夠抑制糖尿病大鼠心肌氧化應激損傷，增強機體損傷修復能力，并改善心肌的組織病理學變化，其機制可能與激活AMPK/eNOS 信號通路有關。

綜上所述，疏肝清熱通絡方能夠明顯降低2 型糖尿病大鼠血糖及血脂水平，抑制脂肪酸合成酶基因的表達，激活AMPK/eNOS 信號通路，改善大鼠心肌氧化應激水平及組織病理學變化。