污水廠中草甘膦降解菌的篩選及其降解特性研究

許 斌，韓 萍，薛玉芬

（1青島市團島污水處理廠，山東青島 266002；2青島水務集團環境能源有限公司，山東青島 266002）

0 引言

草甘膦是一種廣譜滅生性除草劑[1]。近年來，隨著農業的發展和環保措施的相對滯后，中國土壤、水體中的草甘膦污染越來越嚴重[2]。許多研究證實，利用微生物治理草甘膦污染水體和土壤是最有前景的手段[3]。近年來的研究表明，當草甘膦進入土壤后，由于吸附到土壤有機物和粘土顆粒上而停留的時間較長[4]，長期使用對環境中的微生物和水生生物具有較強的毒害作用[5]。土壤中的草甘膦易發生水解、光化學降解、生物降解等，而生物降解是草甘膦降解的最主要途徑。目前發現降解草甘膦的微生物主要有細菌和真菌，但自然環境復雜多變，影響微生物的降解效率[6]。因而，人工篩選或馴化高耐受性的菌株，再將其釋放至環境中去，有助于提高草甘膦降解的速率，對草甘膦污染的土壤、水體等的修復具有重要意義。

近年來，對于草甘膦降解菌篩選研究較多。賀望興等[7]采用生物富集、農藥馴化等方式從茶園草甘膦污染土壤中篩選出一株潛在降解菌株CGL-1菌株，經鑒定為微球菌屬，對草甘膦的最高耐受濃度為1200 mg/L。張慧芳等[8]從草甘膦農藥污染的環境分離篩選到2株具有高效穩定的草甘膦降解能力的菌株B-1和Y-1，分別為越南伯克氏菌和硝基還原假單胞菌，在以草甘膦農藥(400 mg/L)為唯一碳源的MSM培養基中對草甘膦農藥的降解率分別為92.64%和87.73%；全鑫等[9]從受草甘膦污染的土壤中以草甘膦為唯一碳源進行篩選，發現QB-7菌株，鑒定該菌株為節桿菌屬，在草甘膦濃度為12 g/L的培養基中，搖床培養7天后的降解率高達99.34%。以上研究表明，環境中存在著種類繁多的能耐受草甘膦的菌群，不同菌屬對草甘膦都顯示較好的降解效能。

目前，已經發現多種微生物（如真菌[10]、細菌[11-12]等）能以草甘膦為唯一的磷源、碳源或氮源，表現出極高的降解率[13]，但相對于豐富的微生物菌群，目前對草甘膦降解菌的認識和研究仍然不夠，為進一步豐富草甘膦降解菌的品種，篩選高效降解菌，本實驗擬從污水處理廠活性污泥中分離、純化、富集、馴化菌株，并對其草甘膦降解特性及環境影響因素進行研究，為草甘膦污染水體的生物處理技術提供更大可能[14]。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

從青島市某污水處理廠的活性污泥中分離獲得。

1.2 培養基

1.2.1 無機鹽液態培養基 分別取0.5 g MgSO4、0.5 g KCl、1.31 g K2HPO4、3.0 g NaNO3、0.018 g FeSO4加入1 L的蒸餾水中，再分別加入1.15、2.87 g和5.74 g草甘膦（純度99.8%）試劑，配制成草甘膦濃度分別為100、250和500 mmol/L的無機鹽培養基。

1.2.2 LB培養基 取牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g NaCl 5.0 g加入1 L蒸餾水中加熱融化，調節至pH 7.4～7.6。

1.3 藥品與儀器

1.3.1 主要藥品 草甘膦(99.8%)、溴化鉀、亞硝酸鈉、硝酸鈉、氯化銅、氯化鉻、硫酸(50%)、硝酸(50%)。

1.3.2 主要儀器 生化培養箱、紫外分光光度計、搖床、離心機、振蕩器、pH計、燒杯、移液管、滴管、玻璃棒、容量瓶、250 mL錐形瓶、比色皿等。

1.4 篩選鑒定方法

1.4.1 菌株的篩選和富集 取8份泥樣加入到100 mL含250 mmol/L草甘膦的無機鹽基礎液體培養基中，在28.8℃、127 r/min搖床中振蕩培養1周后，取出10%連續馴化，富集馴化3次后在含250 mmol/L草甘膦的無機鹽平板上涂布富集液，28.5℃培養，挑取單菌落于250 mmol/L濃度草甘膦的無機鹽平板上進行劃線純化，重復2次后保存。

1.4.2 菌株的鑒定 取純化后的該菌株進行鑒定：取培養到對數生長期的純化菌株菌液1.5 mL，6000 r/min離心6 min，加600 μL無菌水洗滌，混勻靜置幾分鐘后，以5000 r/min離心 4 min，倒上清液，溶于 300 μL 無菌水[15]。加5 μL溶菌酶，溶菌酶終濃度(50～100 μg/mL)，37℃保溫1 h，加入1/5體積10%SDS，顛倒，靜置，60～65℃水浴10 min。加1/4體積5 mol/L NaCl，使NaCl終濃度1 mol/L，加等體積苯酚氯仿去蛋白。取上清，加0.6～0.8倍體積的異丙醇，旋轉使變成一團，1000 r/min離心10 min，倒去上清，加乙醇，真空抽干乙醇，溶解于去離子水中[16]。PCR引物采用真細菌16S rDNA通用引物：5’-GGACTAHAGGGTATCTAAT-3’和 5’-AGAGTTTGATCMTGG-3’。PCR擴增體系總體積為100 μL，其中去離子水65.5 μL，10 XPCR buffer（不含Mg2+）10 μL，MgCl22 uL，dNTP(20 mmol/L)10 μL，引物5 μL，模板DNA 5 μL，Taq DNA聚合酶2 μL。PCR程序為：94℃預熱5 min，94℃變性30 s，33℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環30次，72℃延伸5 min。電泳，EB染色，紫外凝膠成像系統分析結果。PCR擴增產物經DNA純化系統純化后，交由上海生物工程技術公司進行序列測定。

1.4.3 菌株生長量測定 取分離篩選出的菌株放入牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在28.8℃，127 r/min搖床震蕩培養，分別出在10%的培養液中培養0、6、12、18、24、30、36、42 h和48 h，用紫外分光光度計（波長600 nm處）測定其OD值，畫出其生長曲線，并記錄對數期。

1.4.4 草甘膦標準曲線的繪制 首先稱取0.003 g（精確至0.0002 g）質量分數99.8%的草甘膦，用水配制成250 mL草甘膦溶液后，分別配制14 g/L亞硝酸鈉溶液、體積比為50%的硫酸溶液和250 g/L的溴化鉀溶液，精確吸取草甘膦標準溶液0.4、0.55、0.7 mL和1.0 mL于編號為1～5號容量瓶中，并在容量瓶中再分別加入蒸餾水和之前配好的用于亞硝基化反應液（5 mL蒸餾水、0.5 mL硫酸溶液、0.1 mL硝酸鉀溶液、0.5 mL亞硝酸鈉溶液）后，放置20 min，用蒸餾水將其稀釋至刻度，搖勻，備用，用紫外分光光度計法測定草甘膦含量[17]。

1.4.5 草甘膦降解率的測定 不同草甘膦濃度：根據生長曲線找出該菌開始對數期的時間，并在該時間段取出1 mL的菌液分別接入100 mL草甘膦濃度分別為100、250和500 mmol/L的無機鹽液體培養基中，在30℃，127 r/min搖床中振蕩培養。按10%的量分別取兩份0、8、16、24、32、40和48 h時的液體培養基。

不同pH：配置1 L草甘膦濃度為250 mmol/L的無機鹽液態培養基100 mL分裝在250 mL的三角瓶中，用10%的HCI和10%的NaOH調整三角瓶中的酸堿度，用pH計測定，使唯一碳源培養基的pH分布：1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，將預先培養至對數生長期的培養液，按照2%的接入量，接種于含草甘磷250 mmol/L的不同初始pH的無機鹽液態培養基中，30℃，180 r/min搖床中振蕩培養48 h。

在100 mL含草甘膦250 mmol/L的無機鹽液態培養基中分別加入濃度為50 mg/kg和150 mg/kg的Cu2+，濃度分別為0.25 mg/kg和2.5 mg/kg的Cd2+，并按5%的接種量接入濃度為250 mg/kg草甘膦的無機鹽液態培養基中，培養至對數生長期，設不加重金屬為對照組(CK)。

取上述需測定生長曲線時用的菌液，包括不同濃度，不同pH，重金屬條件下的菌液。離心后取上清液并加入反應液后，將紫外分光光度計的波長調節至243 nm，測其吸光度，并根據標準曲線的方程，得出剩余濃度，根據草甘膦剩余濃度與初始濃度之比計算出草甘膦的降解率。

2 結果與分析

2.1 草甘膦降解菌株的富集和篩選

2.1.1 菌株PP84的形態特征及顯微鏡下的形態觀察 通過反復劃線、分離、純化，在以草甘膦為唯一碳源的選擇培養基上得到可以降解草甘膦的菌株PP84，在基礎固態培養基上27.5℃培養32 h后，培養基上出現白色、表面光滑、濕潤、粘稠、隆起、邊緣整齊、半透明的圓形菌落（圖1）。革蘭氏染色后顯微鏡觀察可知，該菌體呈桿狀，無鞭毛，為革蘭氏染色陽性反應。

圖1 LB培養基中菌株形態

2.1.2 16S rRDNA序列測定 為進一步確定菌株PP84的分類學位置，測定了其16S rDNA的部分基因序列。所得到的部分16S rDNA基因序列長度為690 bp，該序列在GenBank中的登錄號為KX356681。將PP84的16S rDNA基因輸入GenBank數據庫，進行BLAST比對，表明該菌株的16SrDNA基因序列與數據庫中多個菌種的同源性都為100%，它們分別是Bacillussp.FJAT25768(KU161292.1)、BacillusspFJAT257668(KR077857.1)、Bacillusmegaterium.strainBS9(KR0631831.1)、Bacillusmegaterium.strain.XT31(KF797989.1)、Bacillusmegaterium.strainL24(KU179337.1)、Bacillusmegaterium.strainL15(KU179331.1)、Bacillusmegaterium.strain.AIMST(JQ012010.1)、Alcaligenessp.(AJ002808.1)和Alcaligenessp.(EF540877.1)。綜合形態特征和16S rDNA序列分析結果，PP84菌株被鑒定為巨大芽孢桿菌。巨大芽孢桿菌是自然界中具有降解有機物性能的菌種之一[18]，實驗中巨大芽孢桿菌PP84可以在只有草甘膦作為碳源的液體無機鹽培養基上良好生長，可以證明該菌具有降解草甘膦的能力。

2.1.3 PP84在牛肉膏蛋白胨液態培養基中的生長曲線 由圖2可以看出，在LB培養基中的菌種，適應期只有6 h左右，6 h的OD600值為0.27。之后大約在10～12 h時為菌株PP84的生長對數期，12 h的OD600值為2.13。在培養16～20 h左右進入了穩定期，18 h的OD600值為2.46。培養至24 h時OD600值為2.54。在30 h到達了最大生長量，30 h的OD600值為2.62。培養至36 h時，OD600值為2.69。42 h的OD600值為2.75。培養至48 h時的OD600值為2.81。由此可以看出，菌株PP84培養到30 h時，生長逐漸緩慢，生長量的變化不再明顯，由此菌株PP84進入了生長穩定期。本實驗取在生長對數期的菌株，即取10 h的菌液為母液，以5%的接種量接入含草甘膦的無機鹽培養基中。

圖2 菌株生長曲線圖

2.2 菌株的降解特性討論分析

2.2.1 PP84降解菌在不同濃度草甘膦的降解量的分析 圖3為草甘膦起始濃度在100、250、500 mmol/L時的草甘膦降解率曲線。從圖中可以看出，PP84菌株對草甘膦降解性能良好，無明顯差異，隨著菌株的生長，草甘膦降解率逐漸升高。在試驗條件下，菌株PP84在100 mmol/L、250 mmol/L、500 mmol/L的草甘膦培養基中培養48 h之后的降解率分別為48.02%、51.24%、54.67%。

圖3 不同濃度草甘膦的降解量

2.2.2 pH對菌株PP84降解草甘膦的影響分析 在草甘膦含量為250 mmol/L的培養基中，調節其pH分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和 9.0，可得出菌株PP84在不同pH環境下對草甘膦的降解情況，如圖4所示。由圖可以看出，當pH 1～3時，菌株PP84生長受到迫害，生長受到抑制，導致菌株PP84降解草甘膦的作用較小，草甘膦降解率最高僅能達到3.2%左右。當調節至pH 4.0時，菌株PP84生長情況明顯變好，對草甘膦的降解作用也明顯增強，降解率突增至20.5%。當逐漸調至中性時，隨著環境的酸度越來越小，菌株PP84逐漸適應環境并且生長情況逐漸變好，當調節至pH 6.0時，在此環境下，菌株PP84的生長情況最為良好，降解作用也最大，培養48 h后的降解率達到55.9%。當調節至pH 7.0時，由于菌株PP84本身的適應條件，雖然環境為中性，但菌株PP84的生長量較pH 6.0時略有下降，故其降解草甘膦的作用也比pH 6.0時的作用要小，其降解率降至為34.7%。當調節至pH 8.0、9.0時，環境逐漸偏于堿性，菌株PP84在此環境下的生長量也降低，降解率同時降低，當調節至pH 9.0時，草甘膦降解率降至為22.1%。

圖4 不同pH下草甘膦的降解量

2.2.3 重金屬Cu2+、Cd2+對菌株PP84菌種降解草甘膦的影響 為進一步研究重金屬離子對菌株降解性能的影響，本實驗選取Cu2+、Cd2+作為代表研究其對PP84菌株降解性能的影響。圖5顯示Cu2+對PP84菌株降解草甘膦性能的影響。由圖可以看出，菌株PP84在培養10 h后，未添加Cu2+時，草甘膦降解率能達到65.6%，當Cu2+為50 mg/kg時，降解率稍有下降，但仍能達到58.9%，當Cu2+濃度在150 mg/kg時，降解率下降明顯，僅為37.9%。由此可以看出，重金屬Cu2+對菌株有一定的毒害作用，能影響PP84菌株對草甘膦的降解性能，在一定范圍內，隨著Cu2+離子濃度的增加，毒害作用增強，會抑制草甘膦的降解。

圖5 Cu2+對草甘膦降解的影響

Cd2+其毒性較強，對菌株PP84降解草甘膦的作用有一定的抑制[19]。試驗探究了Cd2+對菌株PP84降解草甘膦的影響，結果如圖6所示。由圖可看出，菌株PP84在培養10 h后，表現出與Cu2+相似的趨勢，隨著Cd2+濃度的增大，對菌株PP84生長的抑制作用就越強，草甘膦降解率就越低。在CK組中，草甘膦降解率能達到60%，而當濃度為0.25 mg/kg時，重金屬對菌株PP84起了毒害作用，致使PP84對草甘膦的降解作用受到阻礙，降解率降低為50.4%。濃度為2.5 mg/kg時，降解率為28.8%。由此可以看出，Cd2+濃度越大，對菌株PP84的生長越有害。《土壤環境質量農用地土壤污染風險管控標準（試行）》[20]農用地土壤防控污染風險管控值鎘的濃度在pH 5.5～7.5的范圍內為3.0 mg/kg，通過對比發現，PP84菌株也可以用于重金屬Cu、Cd污染的土壤中草甘膦污染的生物修復。

圖6 Cd2+對草甘膦降解的影響

3 討論

本實驗中從青島市某污水處理廠活性污泥中，以草甘膦為唯一碳源進行篩選和富集得到菌株后，選出一株作為實驗菌株PP84，通過對它的形態的觀察得到該菌株呈乳白色，表面光滑濕潤，芽胞為圓形。通過生化實驗，得出菌株PP84為革蘭氏陽性菌。再通過DNA序列的對比，菌株PP84鑒定為巨大芽孢桿菌。實驗中巨大芽孢桿菌PP84可以在只有草甘膦作為碳源的液體無機鹽培養基上良好生長，可以證明該菌具有降解草甘膦的能力。運用紫外分光光度法測定PP84菌在草甘膦中的生長情況和草甘膦的降解率進一步證明了這個事實。

3.1 菌株的降解特性分析

環境中草甘膦的濃度對巨大芽孢桿菌降解草甘膦的特性有一定的作用。在一定范圍內，隨著草甘膦濃度的增加，降解作用越好，降解效率也越大。當草甘膦濃度達到500 mmol/L時，PP84菌株可以得到很多的營養而迅速的生長，導致降解率也不斷的增加，表現出最好的降解性能。但根據韓麗珍等[21]的研究表明，當草甘膦濃度增加到一定的濃度后，會因為草甘膦本身的毒性，對降解菌起一定的毒害作用，從而明顯抑制菌株的生長，導致降解率的下降[22-23]。

3.2 不同pH對草甘膦的降解量的影響

在對環境因素pH影響巨大芽孢桿菌PP84降解草甘膦的特性研究中發現，巨大芽孢桿菌菌株對酸堿的變化能夠很好的適應，雖然不能在強酸(pH＜2.0)和堿性條件下良好生長，但適應范圍較寬，并且在pH 6.0時，菌株生長情況會最好，對草甘膦的降解作用也可達到最好。通過對比膠紅酵母菌等[24]的研究可以得知，膠紅酵母有很強的適應環境的能力同時對草甘膦的耐受力很強[25-26]，相比較下來，本實驗篩選出來的菌株PP84，適應環境能力和降解效率雖沒有膠紅酵母高，但其具有較寬的酸堿適應范圍，能夠適應環境中酸堿變化，值得篩選富集并運用。

3.3 重金屬Cu2+、Cd2+對菌株PP84菌種降解草甘膦的影響

當環境中有重金屬時，因為重金屬毒害作用，所以對巨大芽孢桿菌的生長也起一定的抑制作用，從而抑制降解，抑制作用隨著重金屬的濃度增大而增大[27]。這個在重金屬環境下的降解特性與劉麗琴等[28]研究的草甘膦降解菌是有一定的差異，本實驗的菌株PP84無論在Cd2+還是在Cu2+的條件下菌株的生長都受到重金屬的抑制，且抑制作用隨著重金屬離子濃度的增大而增大，根據劉麗琴等的研究，降解菌G-6在有Cu2+的條件下降解草甘膦的作用，雖然同樣受到抑制，但其在高濃度Cu2+的時候抑制作用反而不及低濃度的抑制作用，這主要由菌株本身的特性決定的。與其他草甘膦降解菌的特性相比，菌株PP84生長迅速且在對不同濃度的草甘膦的降解作用都很客觀，運用反而較廣。且菌株PP84的耐酸堿性更為寬泛，對重金屬的耐受性較寬，可以運用在工農業廢水之中。

4 結論

通過實驗可以得出，從青島某污水廠活性污泥中篩選的PP84菌株能夠在以草甘膦為唯一碳源的基礎鹽培養基上生長，已證明其能夠利用草甘膦，且在合適的培養基(pH 6,250 mmol/L)中，48 h的草甘膦降解率可達到55.9%。在對環境因素影響巨大芽孢桿菌PP84草甘膦降解特性的研究中發現，菌株PP84對酸堿的變化能夠很好的適應，雖然不能在強酸(pH＜2.0)的條件下良好生長，但適應范圍較寬，并且在特定的pH下，菌株生長情況會很好，對草甘膦的降解作用也可達到最好。當環境中有Cu、Cd重金屬時，因為重金屬毒害作用，對巨大芽孢桿菌的生長起一定的抑制作用，抑制作用隨著重金屬的濃度增大而增大。但與其他草甘膦降解菌的特性相比，菌株PP84生長迅速且在對不同濃度的草甘膦的降解作用都很客觀，且菌株PP84的耐酸堿性更為寬泛，對重金屬的耐受性較寬，可以運用在改善農藥污染土壤和水體的工程中。因為它的生長量和對外界的適應效果很好，所以是一種可以長期使用的菌種，且因為菌株的耐受力比較強，不僅可以將其運用在含草甘膦的工業農業廢水處理之中，同時對于土壤修復也具有重要意義，因此，該菌株PP84具有良好的應用前景。