番茄MYB44基因生物信息學及亞細胞定位分析

李 穎，王瑩瑩，蘇 旭，谷建田

（北京農學院植物科學技術學院，北京 102206）

0 引言

番茄(SolanumlycopersicumL.)，俗名西紅柿，原產南美洲，是管狀花目、茄科、番茄屬的一種草本植物，在中國南北方各地均普遍栽培。番茄屬于喜溫性蔬菜，耐寒性較差，在番茄的不同生長發育階段，需要相適應的溫度，其中幼苗期的最適溫度20～25℃，夜溫10～15℃[1]。冷害會發生在番茄生長發育的每個階段，導致番茄生長發育不良、落花落果，使番茄年產量降低，造成嚴重的經濟損失[2]。番茄幼苗期是對冷害比較敏感的時期，為了提高番茄幼苗期的耐寒能力，增加番茄生產效益，有關番茄抗寒基因的功能研究逐漸成為熱點。MYB家族是植物中功能最多樣化、數量最多的轉錄因子家族之一。在擬南芥中，已鑒定出超過1600個轉錄因子基因，約占全基因組的6%[3]，而MYB家族約占擬南芥總轉錄因子家族的9%[4]。MYB轉錄因子不僅能對激素以及干旱高溫高鹽等逆境脅迫做出應答[5-6]，而且廣泛參與植物初生和次生代謝反應[7-8]，并對植物的生長發育和形態建成[9-10]具有重要的調控作用。已有研究表明番茄MYB類轉錄因子在響應低溫脅迫方面發揮著重要作用，如：過表達SlMYB41基因使番茄植株對低溫更加敏感，而將該基因沉默之后，植株則更能抵御低溫脅迫，表明SlMYB41基因是番茄低溫抗性的負調控因子[11]。過表達SlMYB113基因的表達量，能夠增加花青素的積累，提高了轉基因番茄植株的抗寒性，表明SlMYB113基因是番茄響應低溫脅迫的正調控因子[12]。另外，超表達SlGAMYBL2基因提高了轉基因煙草ABA、甘露醇以及低溫脅迫抗性[13]。番茄SlMYBL基因的表達在低溫脅迫下受到不同程度的誘導[14]。而SlMYB44基因作為MYB家族的一員，關于該基因在番茄響應低溫脅迫中的功能研究甚少。本研究基于轉錄組測序結果，篩選出差異表達基因SlMYB44開展生物信息學分析，構建表達載體pMDC43-MYB44進行亞細胞定位分析，為后續研究番茄SlMYB44基因低溫響應機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試番茄品種為實驗室自存俄羅斯普通番茄品種Bolgogragsky，煙草品種為本氏煙草。DH5α大腸桿菌感受態購于北京擎科生物科技有限公司；EHA105農桿菌感受態細胞購于北京華越洋生物科技有限公司；TRzol總RNA提取試劑盒、質粒小提快速試劑盒購于北京博邁德基因技術有限公司。其他試劑盒為實驗室常用試劑盒，其他生化試劑為分析純。試驗在北京農學院植物科學技術學院實驗室，于2020年8—12月進行。

1.2 主要儀器

GHB-100金屬浴，杭州博日科技有限公司生產；85-2數顯恒溫磁力攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司生產；EPS 100型電泳儀，上海天能科技有限公司生產；THZ-C-1臺式冷凍恒溫振蕩器，太倉市實驗設備廠生產；MLS-3750自動高壓滅菌鍋，日本SANYO公司生產；PCR儀，美國Bio-Rad公司生產；ZHWY-103D恒溫培養振蕩器，上海智誠分析儀器制造有限公司生產；DTY-ZBJ-100制冰機、超凈工作臺，北京德天佑科技發展有限公司生產；低溫生化培養箱，北京博宇寶威試驗設備公司生產。

1.3 試驗方法

1.3.1SlMYB44基因生物信息學分析 從美國國家生物技術信息中心得到番茄SlMYB44mRNA序列，蛋白氨基酸序列FASTA格式：MAITTNSSKRDMDRVK GPWSPEEDELLQQLVQKHGPRNWS LISKSIPGRSG KSCRLRWCNQLSPQVEHRAFTPEEDETIIRAHARF GNKWATIARLLNGRTDNAIKNHWNSTLKRKCSSLS ADEGNELADQLFENQQPPLKRSVSAGSAMPVTGF HFSPGSPSGSDSDSSLHVTSSSQSQVFKPVARTGGV FPPSIDISSPPVDPPTSLSLSLPGVDLAESSNRSADST QSKNPFQWLLPPMQIPPPPPPPPPPLATTVPFERVSA IQQSLQNPDFGQNSGGEQPDKVFVPFSQELLGVM QEMIKTEVRNYMMGVEQKQQYQRQHYQQQQPQ QFQQQNHQLPSGLGLGLCMQQASDCFRDRAANR MGLSKFD。在NCBI中Conservation Domain程序進行基因保守結構域分析；將氨基酸序列輸入ExPASy ProtParam在線軟件中，分析SlMYB44的蛋白分子量、脂肪指數、不穩定系數、氨基酸組成等參數，ExPASy ProtScale在線軟件分析蛋白所對應的每一個氨基酸的親疏水性；將該蛋白氨基酸的FASTA文件輸入TMHMM Server v.2.0進行SlMYB44跨膜預測分析；利用在線網站Signa1P Server分析SlMYB44信號肽，設置Cut-off值為0.45，其他參數為系統默認參數。C分數為原始卵裂位點得分，CS網絡的輸出，可以區分信號肽切割位點與其他所有位點。S分數為信號肽分數。SP網絡的輸出，可以將信號肽中的位置與蛋白質成熟部分中的位置以及沒有信號肽的蛋白質區分開。Y得分為合并切割位點得分，即C分數和S分數的斜率的組合，比單獨的原始C分數產生更好的切割位點預測。當S＞0.5時，為分泌蛋白且有信號肽，Y的最大值用來判斷信號肽的剪切位點；利用SOPMA進行SlMYB44蛋白二級結構預測，參數默認為原始參數；利用Swiss Model軟件進行同源建模預測三級結構；啟動子分析運用PlantCARE，統計并分析SlMYB44啟動子所包含的順式作用元件。

1.3.2 亞細胞定位

（1）pMDC43-MYB44載體構建

模板擴增：利用Trizol法提取葉片RNA，然后用全式金的TransScript?第一鏈合成試劑盒將純化后的總RNA反轉錄為cDNA，于-20℃冰箱保存。根據NCBI上提供的番茄SlMYB44基因序列(LOC101249225)，利用設計好的引物，以番茄葉片cDNA為模板，對目的片段進行PCR擴增。

PCR產物回收：加入4倍體積的Buffer CP到1.5 mL離心管；劇烈震蕩，短暫離心；把吸附柱放在收集管里；把步驟3的混合物轉入吸附柱；13800 r/min離心1 min，棄濾液；加入700 μL洗脫液，13800 r/min離心1 min，棄濾液；加入500 μL洗脫液，13800 r/min離心1 min，棄濾液；13800 r/min離心2 min，甩吸附柱上的乙醇；把吸附柱轉移到新的1.5 mL離心管，在其中心加入30 μL ddH2O，室溫放置1 min；13800 r/min離心2 min，濾液即是回收的DNA；PCR產物連接表達載體。

載體雙酶切及連接：配制20 μL（體積）的雙酶切連接體系：ddH2O 6 μL；10×FastDigest Green Buffer 2 μL；Vector 10 μL；FastDigest AscI or NcoI 1 μL；FastDigest SacI or PstI 1 μL。配制 10 μL LIC 連接體系 ：5×InFusion Mix 2 μL；target 5 μL；Vector 3 μL；FastDigest AscI or NcoI 1 μL；FastDigest SacI or PstI 1 μL。輕輕搖勻，短暫離心；50℃放置15 min；按照大腸桿菌DH5α說明書步驟將連接產物進行轉化，挑取單克隆進行PCR陽性驗證。如果跑出條帶，則提取質粒進一步測序驗證。

（2）農桿菌轉化和亞細胞定位：按照熱擊法，把測序正確的質粒按照EHA105農桿菌感受態細胞說明書步驟進行轉化，接種正確克隆于LB液體培養基中搖菌擴繁，用等體積的buffer(10 mmol/LMES，200 μmol/L AS，10 mmol/L MgCl2)懸浮28℃培養至OD600=0.3的農桿菌菌液，并在室溫下靜置4～6 h活化，然后由下表皮注射到4周大的煙草葉片背面，繼續培養4～6天后采集葉片置于激光共聚焦顯微鏡下，直接觀察葉片的熒光情況。

2 結果與分析

2.1 SlMYB44轉錄因子生物信息學分析

2.1.1 SlMYB44轉錄因子的保守結構域分析SlMYB44基因全長1551 bp，編碼372個氨基酸，它除了含有典型的MYB轉錄因子家族的DNA結構域，還含有PLN03091、REB1和SANT結構域（圖1）。

圖1 SlMYB44基因保守結構域分析

2.1.2 SlMYB44轉錄因子所編碼蛋白理化性質分析 SlMYB44蛋白的相對分子質量為41247.25，理論等電點PI為8.25，說明蛋白偏堿性。蛋白質的總分子式為C1797H2819N527O560S15，原子總數為5718。氨基酸數為372個，其中 Arg(R)21 個(5.6%)、Asn(N)17 個(4.6%)、Asp(D)18個(4.8%)、Cys(C)5個(1.3%)、Gln(Q)37個(9.9%)、Glu(E)17 個(4.6%)、Gly(G)23個(6.2%)、His(H)8個(2.2%)、Ile(I)12個(3.2%)、Leu(L)29個(7.8%)、Lys(K)16個(4.3%)、Met(M)10個(2.7%)、Phe(F)15個(4%)、Pro(P)38個(10.2%)、Ser(S)45個(12.1%)、Thr(T)15 個(4%)、Trp(W)6 個(1.6%)、Tyr(Y)15個(4%)、Val(V)18個(4.8%)。帶負電荷的殘基總數（Asp和Glu）為35個，帶正電荷的殘基總數（Arg和Lys）為37個。SlMYB44蛋白的不穩定指數為63.96，因此將該蛋白質歸類為不穩定蛋白。脂肪指數為62.12，總平均親水性為-0.732。預測該蛋白的半衰期為：在哺乳動物網織紅細胞中30 h，在酵母中大于20 h，在大腸桿菌中大于10 h。在該蛋白親疏水性分析中，最大疏水性值為1.533，最大親水性值為-3.411。如圖2所示，在SlMYB44蛋白中親水性的氨基酸明顯更多，說明該蛋白屬于親水性蛋白。

圖2 SlMYB44蛋白的理化性質分析

2.1.3 SlMYB44轉錄因子所編碼蛋白信號肽分析 切割位點C的最大值為0.132，位于29位氨基酸；信號肽分數S的最大值為0.261，位于8位氨基酸；合并切割位點Y最大值為0.147，位于29位氨基酸。S平均值0.171，其預測的剪切點在1～28位氨基酸。S平均值遠遠低于0.5，說明SlMYB44蛋白為非分泌蛋白，沒有潛在的信號肽位點（圖3）。

圖3 SlMYB44蛋白信號肽預測

2.1.4 SlMYB44轉錄因子所編碼蛋白跨膜域分析 SlMYB44轉錄因子所編碼的372個蛋白氨基酸均不在跨膜區，說明SlMYB44蛋白不含跨膜結構，不屬于跨膜蛋白（圖4）。

圖4 SlMYB44蛋白跨膜域預測

2.1.5 SlMYB44轉錄因子所編碼蛋白二級結構預測分析 SlMYB44蛋白中有233個氨基酸殘基組成不規則卷曲，含量高達62.63%，其次為α-螺旋，占25.54%，延伸鏈占8.06%，最少的是β-折疊，僅占3.76%（圖5）。

圖5 SlMYB44蛋白二級結構預測

2.1.6 SlMYB44轉錄因子所編碼蛋白三級結構預測分析 為了解SlMYB44蛋白的三維結構，利用Swiss Model軟件對其進行同源建模，獲得三維效果圖（圖6）。

圖6 SlMYB44蛋白三級結構預測

2.1.7 SlMYB44轉錄因子啟動子順式作用元件分析 利用軟件Plant CARE對SlMYB44基因啟動子序列上的順式作用元件進行預測分析，并對結果進行分類整理，如表1所示。表明在SlMYB44基因順式作用元件中，大部分與逆境脅迫、激素響應等元件相關。

表1 SlMYB44基因啟動子順式作用元件分析

2.2 SlMYB44轉錄因子亞細胞定位

2.2.1 pMDC43-MYB44載體構建

（1）引物設計及擴增

根據NCBI上提供的番茄SlMYB44基因序列設計特異性引物（表2），選取SlMYB44基因擴增編碼區cDNA序列片段，對其進行擴增，得到了全長1119 bp的目的片段（圖7）。

表2 引物設計列表

圖7 KOD-FX擴增

（2）pMDC43-MYB44的菌落PCR鑒定

PCR產物回收后，根據無縫連接試劑盒，進行連接轉化。分別挑取4～8個克隆PCR鑒定，PCR擴增所用引物為載體上的測序引物(43F/43R)（圖8）。

圖8 載體pMDC43-MYB44菌液PCR結果

2.2.2 亞細胞定位及熒光觀察 網站ProtComp 9.0預測分析結果表明SlMYB44蛋白定位在細胞核內。本實驗中，根據氨基酸表達分析和熒光形態白場位置判斷，自發光的信號來自于葉綠體，從圖中可以看出，綠色和紅色沒有重合，說明SlMYB44蛋白沒有在葉綠體中表達。SlMYB44蛋白的熒光信號出現在細胞核上，陰性對照的空載熒光信號分布在細胞核以及細胞膜上。說明SlMYB44蛋白大部分表達于細胞核，與預測結果一致（圖9）。

圖9 亞細胞定位圖

3 討論與結論

R2R3-MYB蛋白是植物特有的最豐富的物種，在植物的基因組中大約有100多個R2R3-MYB成員，積極參與植物生長發育、次生代謝調控、生物和非生物脅迫應答[15]。MYB44是典型的R2R3-MYB轉錄因子，通過基因槍介導法將帶有AtMYB44基因的表達質粒導入小麥幼胚誘導的愈傷組織中，證明擬南芥AtMYB44基因對小麥抗病能力存在影響[16]。將擬南芥AtMYB44基因轉入水稻，表明該基因過量表達明顯提高了水稻對低溫脅迫的耐受性[17]。馬鈴薯StMYB44、StMYB44b基因能夠在植物響應蔗糖中起重要的調控作用[18]。茄子SmMYB44轉錄因子通過激活亞精胺合酶的表達來增強抗病能力[19]。擬南芥AtMYB44通過依賴于SA防衛信號通路正調控其抗病性[20]。馬鈴薯StMYB44通過抑制磷轉移相關基因StPHO1表達負調控磷的轉運[21]，說明MYB44基因在響應逆境脅迫中發揮著重要的作用。番茄SlMYB44基因順式作用元件分析也表明大部分與逆境脅迫、激素響應等元件相關，亞細胞定位結果表明SlMYB44蛋白大部分表達于細胞核。該結果對于探索SlMYB44在番茄抗寒過程中發揮的作用，豐富MYB基因家族成員的研究提供生物信息學參考。為了更深入地探尋該基因在番茄耐冷脅迫中發揮的作用，下一步可構建過表達載體并對番茄外殖體進行遺傳轉化，對過表達陽性植株進行低溫處理并測定相關生理生化指標。同時也可以根據亞細胞定位結果進行蛋白互作位置研究，進一步探究番茄SlMYB44基因信號轉導、基因調控、蛋白互作和分子調控機制。