甜菜M14品系BvM14-RIN4基因的克隆及應答鹽脅迫分析

賈惠旭，李海英，端木慧子

（1黑龍江大學農業微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 1500500；2黑龍江大學生命科學學院/黑龍江省普通高校分子生物學重點實驗室，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜M14品系是由栽培甜菜(BetavulgarisL.)與野生白花甜菜(BetacorollifloraZoss.)雜交及多次回交所獲得的甜菜單體附加系[1]，附加了野生白花甜菜第9號染色體；前期實驗表明甜菜M14品系擁有耐鹽和無融合生殖等優良性狀，是用于挖掘優質基因的良好材料[2-3]。

RIN4(RPM1-interacting protein 4)存在于多種單子葉植物和雙子葉植物中，如番茄、煙草、大豆、玉米和萵苣等[4-5]，是植株正常生長發育所必需的蛋白質。RIN4是病原相關分子模式(PAMP)激發的免疫反應PTI(PAMP-triggered immunity)的負調節因子，其在免疫應答中的作用機制已有明確報道，rin4基因的擬南芥突變株系可以增強了PAMP誘導的防御信號，從而激活擬南芥的免疫應答[4-11]。最近的研究也表明，RIN4也參與了效應因子觸發的免疫反應ETI。RIN4是效應因子AvrB，AvrRpm1和AvrRpt2的靶蛋白[5-8]。正常情況下，RIN4與抗病R蛋白結合，R蛋白保持非活性狀態。當丁香假單胞菌侵染植物細胞時，細菌中的效應因子AvrB，AvrRpm1和AvrRpm2通過磷酸化或降解RIN4，從而釋放抗病R蛋白，以此為信號啟動植物體內的防御應答，促使植物體內一系列防衛機制的產生[12-17]。

RIN4基因除了參與免疫應答，還參與了非生物脅迫。研究顯示，擬南芥RIN4與14-3-3蛋白形成復合物被質膜家族成員GCN4降解后，調節氣孔開閉，從而響應干旱脅迫[18]；胡楊(Populuseuphratica)PeRIN4基因在擬南芥中異源表達會增強細胞外排H+的能力，并且抑制了細胞內K+外流，這兩方面共同作用，維持了植物體內K+/Na+平衡，使轉基因擬南芥能夠有更高的耐鹽性[19]。RIN4定位于質膜，它可以通過激活質膜H+-ATPase，進而調控細胞平衡和活性氧平衡，從而使植物應答鹽脅迫[20]。

目前，仍然沒有對RIN4響應非生物脅迫的系統研究。因此，本研究對甜菜M14品系BvM14-RIN4基因進行克隆、生物信息學分析、組織特異性及該基因在鹽脅迫下表達分析，為進一步研究BvM14-RIN4基因功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 植物材料選用甜菜M14品系（專利號：CN1263695A），種植于植物培養室。

1.1.2 主要試劑和引物 First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒與KOD-Plus-Ver.2試劑盒均購于東洋紡（上海）生物科技有限公司。本實驗訂購引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司負責合成。

表1 PCR擴增用到的所有引物

1.2 方法

1.2.1 甜菜M14品系總RNA提取 使用TRIzol試劑提取甜菜M14品系200 mmol/L NaCl處理下根的總RNA。使用NanoDrop儀器檢測RNA樣品的A260/A280，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳評估RNA的純度和完整性。

1.2.2 cDNA第一鏈的合成 按照東洋紡（上海）生物科技有限公司試劑盒First Strand cDNA Synthesis Kit的說明書，進行200 mmol/L NaCl脅迫下甜菜M14品系根cDNA反轉錄。按照30℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min的實驗條件進行反轉錄。

1.2.3BvM14-RIN4基因cDNA全長的獲得 使用Primer Premier 5.0軟件設計基因特異性引物，上游引物為BvM14-RIN4-S，下游引物為BvM14-RIN4-AS。以鹽脅迫下的根RNA反轉錄獲得的cDNA為模板，進行PCR擴增，并使用1%瓊脂糖凝膠檢測PCR產物。PCR 擴增反應：94℃，2 min；98℃，10 s；58℃，30 s；74℃，30 s，循環35次；74℃，7 min。

1.2.4BvM14-RIN4基因生物信息學分析 使用NCBI網站的ORF Finder程序進行開放閱讀框分析；采用ProParam軟件(https://web.expasy.org/protparam/)在線網站對蛋白質的理化性質進行分析；蛋白親水/疏水性分析采用http://us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl在線進行；蛋白質二級結構預測使用SOPMA軟件進行預測；蛋白質三級結構模型使用RaptorX數據庫進行預測；使用NCBI網站的Blastp對BvM14-RIN4蛋白進行同源序列搜索，使用DNAman軟件進行氨基酸多重序列比對；使用MEGA7.0軟件進行系統發育樹的構建。

1.2.5BvM14-RIN4基因組織特異性分析和應答鹽脅迫分析 分別提取200 mmol/L NaCl處理0、3、6、9、12 h甜菜M14品系葉片和根部總RNA，通過逆轉錄，獲得cDNA第一鏈作為模板。通過實時熒光定量PCR技術，以18SrRNA作為內參基因，分析BvM14-RIN4基因在甜菜不同組織的表達模式以及在鹽脅迫下不同組織（根、葉）中不同時間的表達模式，qRT-PCR反應體系和反應程序參考SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說明書設置。每個樣品進行3次技術重復和3次生物學重復，采用2-△△Ct相對定量法計算基因的相對表達量，采用方差分析進行差異顯著性分析，用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 BvM14-RIN4基因的克隆

2.1.1 甜菜鹽脅迫下的根部總RNA的提取 提取樣品的根部總RNA凝膠電泳圖1顯示：28SrRNA條帶的寬度和亮度是18SrRNA條帶的2倍，A260/A280為1.891，濃度為400 ng/μL，RNA完整性很好，無降解，可用于后續試驗。

圖1 甜菜M14品系根部總RNA提取1%瓊脂糖凝膠電泳結果

2.1.2BvM14-RIN4基因cDNA全長的獲得 以甜菜M14品系鹽脅迫下的根部總RNA反轉錄所得的cDNA第一鏈為模板，利用特異引物BvM14-RIN4-S和BvM14-RIN4-AS進行PCR反應，產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示：BvM14-RIN4基因PCR擴增條帶大小大約在250 bp左右，條帶大小符合預期，對PCR產物進行凝膠回收并與pMD18-T載體連接，獲得重組載體命名為pMD18-T-BvM14-RIN4。連接產物轉化DH5α感受態細胞，篩選鑒定陽性克隆子，送至測序公司測序，結果顯示克隆成功。

圖2 BvM14-RIN4基因cDNA全長產物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 BvM14-RIN4基因的生物信息學分析

2.2.1BvM14-RIN4基因的開放閱讀框分析 開放閱讀框分析結果如圖3所示：cDNA序列全長為264 bp（包括終止密碼子），編碼87個氨基酸。圖中紅色方框為起始密碼子，黑色方框為終止密碼子。

圖3 BvM14-RIN4基因cDNA全長的開放閱讀框

2.2.2 BvM14-RIN4蛋白的理化性質分析 利用Protparam在線軟件分析BvM14-RIN4蛋白的分子式為C415H652N130O132S3，分子量為9.67 kDa，理論等電點(pI)為9.64，帶正電氨基酸殘基總數(Arg+Lys)為13，帶負電氨基酸殘基總數(Asp+Glu)為7，不穩定系數為42.9，脂肪系數為37.01，平均親疏水系數為-1.340。

利用ProtScale在線網站對BvM14-RIN4蛋白進行親/疏水性分析，結果如圖4所示：多肽鏈第83位具有最高分值1.411，疏水性最強：第69位具有最低分值-3.589，親水性最強。此外，整個肽鏈中親水性氨基酸分布較多。總體來看，這條多肽鏈表現出較強的親水性，推測其為可溶性蛋白。

圖4 BvM14-RIN4蛋白序列的親/疏水性預測結果

2.2.3 BvM14-RIN4蛋白的二級結構和三級結構預測 使用SOPMA軟件進行蛋白質二級結構預測，結果如圖5所示。BvM14-RIN4蛋白的二級結構組成包括：4.44%的α-螺旋，5.51%的β-轉角，31.11%的延伸鏈和53.33%的無規卷曲，該蛋白二級結構元件主要為延伸鏈和無規卷曲。

圖5 BvM14-RIN4蛋白的二級結構

使用RaptorX數據庫進行蛋白質三級結構預測，結果如圖6所示，粉色部分為該蛋白的保守結構域，紅色部分為該蛋白的疏水區，白色線條為該蛋白的無序區域。

圖6 BvM14-RIN4蛋白的三級結構預測結果

2.2.4 BvM14-RIN4蛋白氨基酸多重序列比對分析 利用NCBI網站的Blastp對甜菜BvM14-RIN4基因編碼蛋白序列與擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)、煙草(NicotianatabacumL.)、玉米(ZeamaysL.)、萵苣(LactucasativaL.)、藜麥(ChenopodiumquinoaL.)、菠菜(SpinaciaoleraceaL.)等物種的RIN4蛋白的氨基酸序列進行檢索，采用DNAman軟件進行多重序列比對，如圖7所示。結果表明，RIN4擁有2個硝酸鹽誘導結構域NOI（PxFGxW和Y/FTxxF）和含有一個保守的半胱氨酸殘基。BvM14-RIN4蛋白與菠菜(Spinacia oleraceaL.)的氨基酸序列相似度為76.92%。利用軟件MEGA7.0對BvM14-RIN4蛋白與其他物種之間的親緣關系進行系統發育樹分析，如圖8所示，BvM14-RIN4蛋白與菠菜(SpinaciaoleraceaL.)SoRIN4和藜麥(ChenopodiumquinoaL.)CqRIN4蛋白親緣關系最近。

圖7 BvM14-RIN4與其他植物RIN4蛋白多重序列比對

圖8 BvM14-RIN4蛋白的系統發育樹

2.3 BvM14-RIN4基因組織特異性分析和應答鹽脅迫分析

本研究測定BvM14-RIN4基因在0、200 mmol/L NaCl脅迫甜菜M14品系葉、根中0、3、6、9、12、24、48 h的表達情況，結果如圖9，BvM14-RIN4基因在未處理的甜菜M14品系中根的表達量是葉的2.26倍，說明其具有組織特異性。BvM14-RIN4基因在200 mmol/L NaCl處理甜菜M14品系根6、24 h時表達量顯著增加，分別是0 h的1.96倍和6.84倍；該基因在200 mmol/L NaCl處理甜菜M14品系葉中表達量沒有明顯變化。

圖9 甜菜M14品系葉和根BvM14-RIN4基因的應答鹽脅迫的表達情況

3 討論與結論

本研究生物信息學分析結果表明，BvM14-RIN4蛋白是由無規卷曲和延伸連組成的親水性蛋白，與該蛋白在大多數物種中的性質一致[19-20]。三級結構預測結果證實該蛋白為固有無序蛋白(IDP)，IDP可以作為蛋白質復合物形成的樞紐，在信號傳導途徑中起著重要的作用。BvM14-RIN4蛋白具有硝酸鹽誘導的結構域NOI（PxFGxW和Y/FTxxF），NOI最初是從硝酸鹽誘導的基因中鑒定出來的[22]，該NOI結構與鹽脅迫之間的聯系還沒有建立。另外本研究結果顯示，BvM14-RIN4蛋白C末端具有半胱氨酸殘基，DongHyuk等[23]研究表明，擬南芥中AtRIN4半胱氨酸殘基通過翻譯后修飾，可以與周圍的質膜(PM)相連，并使該蛋白定位于質膜；也有研究顯示，胡楊PeRIN4與質膜H+-ATPase相互作用，提高轉PeRIN4基因擬南芥的H+外排能力，因此BvM14-RIN4蛋白可能定位于質膜并與H+-ATPase相互作用從而應答鹽脅迫。BvM14-RIN4蛋白與其他12種植物中RIN4蛋白的氨基酸序列高度同源，該結果表明RIN4蛋白高度保守，且與Tania等[5]有關RIN4蛋白的研究結果一致。此外，進化分析表明BvM14-RIN4蛋白與菠菜(SpinaciaoleraceaL.)SoRIN4和藜麥和和藜麥(ChenopodiumquinoaL.)CqRIN4蛋白親緣關系最近。

BvM14-RIN4基因組織特異性分析結果顯示，BvM14-RIN4基因在未處理的甜菜M14品系中根的表達量是葉的2.26倍，說明其具有組織表達特異性；該基因在鹽處理甜菜M14品系根中表達量顯著增加，且在鹽處理24 h時，表達量達到最大值，是0 h的6.84倍，說明BvM14-RIN4基因響應鹽脅迫，但是該基因在鹽處理的甜菜M14品系葉中表達量沒有明顯的變化，這可能是因為根是直接接觸鹽處理的器官，能快速地應答鹽脅迫，因此在鹽脅迫下根中該基因的表達水平變化明顯。

熒光定量PCR結果顯示，BvM14-RIN4基因參與甜菜M14品系應答鹽脅迫過程，但RIN4基因以何種途徑響應非生物脅迫尚不明確，還需要進一步的基因功能驗證。但隨著研究的不斷深入，基于生物信息學分析所得結果可為后續BvM14-RIN4蛋白功能鑒定、結構分析等研究提供一定基礎信息；而BvM14-RIN4蛋白的同源比對和進化分析結果也為探討植物中RIN4的起源與進化予以借鑒。