LINC00355調控miR-494-3p/CCND2對前列腺癌細胞增殖、侵襲、遷移的影響①

張建育 李毅寧 郭一泓 穆 鑫 福建醫科大學附屬第二醫院泌尿外科泉州362000

前列腺癌是臨床常見惡性腫瘤之一,其發病率逐年升高,但前列腺癌發生及轉移的分子機制尚未闡明[1]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)在多種腫瘤中異常表達并可影響腫瘤細胞增殖、分化等過程[2]。研究表明LncRNA表達異常與前列腺癌發生及發展密切相關[3]。但關于其具體作用機制尚未闡明。長鏈非編碼RNA(LncRNA LINC00355)在腫瘤中呈高表達并可促進腫瘤進展[4]。微小RNA-494-3p(microRNA-494-3p,miR-494-3p)在髓母細胞瘤中呈低表達,上調其表達可抑制腫瘤進展[5]。細胞周期蛋白HD2(cyclin-D2,CCND2)在卵巢癌中表達量升高,下調其表達可抑制腫瘤細胞遷移及侵襲[6]。生物學信息學分析顯示LINC00355與miR-494-3p存在結合位點,miR-494-3p與CCND2存在結合位點,但LINC00355是否可通過調控miR-494-3p/CCND2參與前列腺癌發生及發展過程尚未可知。本研究主要探討前列腺癌組織中LINC00355、miR-494-3p、CCND2的表達,探究LINC00355對前列腺癌細胞增殖、侵襲、遷移的影響,分析其對miR-494-3p、CCND2的調控作用,旨在為揭示前列腺癌發生及轉移的分子機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑 前列腺癌細胞DU145購自美國ATCC細胞庫；杜氏改良培養基(DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000與TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉錄與qRT-PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；LINC00355小干擾RNA(si-LINC00355)(序列:ACGAUCUAUCGAUCGUAG)、亂序無意義陰性對照(si-NC)、miR-494-3p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-494-3p)(序列:GUUUGUUUUCACUAGUCUAGC)及其陰性對照(anti-miR-NC)、miR-494-3p寡核苷酸模擬物(miR-494-3p mimics)(序列:AGUCGAUCUACGUAGCUAGUCG)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA3.1購自上海遠慕生物科技有限公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium,MTT)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)、膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)細胞凋亡試劑盒購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質膠購自美國BD公司；兔抗人P21、上皮鈣黏附素(E-cadherin)、基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)抗體購自美國CST公司；兔抗人CCND2抗體與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.1.2 前列腺癌組織及癌旁組織標本來源 收集2017年2月至2018年12月本院收治的36例前列腺癌患者為研究對象,所有患者均經病理證實為前列腺癌,年齡50～65歲,平均年齡(55.49±6.57)歲,術中切除前列腺癌組織及癌旁組織,置于-80℃超低溫冰箱保存。本研究經本院倫理委員會批準,所有患者知情且簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染及分組 前列腺癌細胞DU145培養于含有10%胎牛血清的DMEM培養基,置于37℃、5%CO2培養箱中培養,取對數期DU145細胞,0.25%胰蛋白酶消化,制備細胞懸液,調整細胞密度為1×105個/ml,接種于24孔板(100μl/孔),待細胞生長融合至70%時參照Lipofectamine2000說明書進行轉染,分別將si-NC、si-LINC00355、si-LINC00355與anti-miR-NC、si-LINC00355與antimiR-494-3p、si-LINC00355與miR-NC、si-LINC00355與miR-494-3p mimics共轉染至DU145細胞,分別記作si-NC組、si-LINC00355組、si-LINC00355+antimiR-NC組、si-LINC00355+anti-miR-494-3p組、si-LINC00355+miR-NC組、si-LINC00355+miR-494-3p組。轉染前2 h更換為不含血清的培養基,轉染6 h后更換為含有10%胎牛血清的DMEM完全培養基,繼續培養48 h收集細胞。

1.2.2 qRT-PCR檢測LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA的表達水平 采用TRIzol法提取前列腺癌組織、癌旁組織及各組DU145細胞中的總RNA,Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度。參照反轉錄試劑盒將總RNA合成cDNA。LINC00355 F:5′-GTCTTGCTTTGTCACCCAGG-3′,R:5′-CTAACACTTTGGGCAGCGTT-3′；miR-494-3p F:5′-CTTCGGCAGCACATATACTAAA-3′,R:5′-TCGACTAGTCCAGCATGTCA-3′；CCND2 F:5′-ACTTGTGATGCCCTGACTGA-3′,R:5′-AAGTTGGGCACAGGTCGATA-3′；U6 F:5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′,R:5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；GAPDH F:5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′,R:5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′,引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。按照RT-PCR試劑盒配置反應體系,置于ABI 7500型熒光定量PCR儀中檢測,反應條件:95℃2 min,95℃30 s,60℃30 s,72℃30 s,共40次循環。LINC00355與CCND2以GAPDH為內參,miR-494-3p以U6為內參,采用2-ΔΔCt法計算LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA相對表達。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖 收集各組對數期DU145細胞接種于96孔板(5×104個/孔),每組設置3個復孔,轉染48 h時,每孔加入質量濃度為5 mg/ml的MTT溶液20μl,37℃培養箱繼續培養4 h,1 300 r/min離心5 min,棄上清,加入150μl DMSO,室溫振蕩孵育5 min,酶標儀檢測各孔吸光度值(490 nm),計算細胞增殖抑制率(%),細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%。

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲 細胞遷移實驗:收集各組對數期DU145細胞接種于24孔板Transwell小室的上室(5×104個/孔),Transwell小室的下室加入含有10%胎牛血清的培養液(600μl/孔),37℃培養箱內培養24 h,棄上清液,PBS洗滌,多聚甲醛固定20 min,PBS洗滌,加入0.1%結晶紫染液染色10 min,棉簽擦拭未遷移的細胞,顯微鏡下觀察遷移細胞數。細胞侵襲實驗:預冷培養液按照9∶1的比例稀釋Matrigel基質膠,加入24孔板Transwell小室的上室(40μl/孔),37℃培養箱內孵育5 h,后續實驗步驟同細胞遷移實驗,顯微鏡下觀察侵襲細胞數。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測LINC00355靶向miR-494-3p及miR-494-3p靶向CCND2 starBase預測顯示LINC00355與miR-494-3p存在結合位點,CCND2的3′UTR含有miR-494-3p的互補序列,采用基因定點突變技術突變結合位點,分別將含有結合位點與突變位點的片段克隆至pmirGLO載體得到野生型載體WT-LINC00355、突變型載體MUTLINC00355、野生型載體WT-CCND2、突變型載體MUT-CCND2,分別將 WT-LINC00355、MUTLINC00355、WT-CCND2、MUT-CCND2與miR-NC、miR-494-3p mimics共轉染至DU145細胞。轉染24 h后收集細胞,檢測細胞相對熒光素酶活性。

1.2.6 Western blot檢測CCND2、P21、E-cadherin、MMP-2蛋白表達 收集各組對數期DU145細胞,采用蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白并檢測蛋白濃度。采用SDS-PAGE分離蛋白,分離的蛋白凝膠轉移至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,加入蛋白一抗(1∶1 000),4℃孵育24 h,TBST洗滌,加入二抗(1∶5 000),室溫孵育1 h,TBST洗滌,加入ECL,暗室內曝光顯影,應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統計學處理 采用SPSS21.0統計學軟件分析數據,計量資料以表示且均符合正態分布,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LINC00355、miR-494-3p、CCND2在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達 與癌旁組織相比,前列腺癌組織中LINC00355與CCND2 mRNA的表達水平顯著升高(P＜0.05),miR-494-3p的表達水平顯著降低(P＜0.05),見表1。

2.2 抑制LINC00355對DU145細胞增殖、遷移、侵襲的影響 與si-NC組相比,si-LINC00355組LINC00355的表達水平顯著降低(P＜0.05),細胞增殖抑制率顯著升高(P＜0.05),遷移細胞數與侵襲細胞數顯著減少(P＜0.05),P21、E-cadherin蛋白水平顯著升高(P＜0.05),MMP-2蛋白水平顯著降低(P＜0.05),見圖1、表2。

表1 LINC00355、miR-494-3p、CCND2在癌旁組織和前列腺癌組織中的表達(，n=36)Tab.1 Expression of LINC00355，miR-494-3p，CCND2 in adjacent tissues and prostate cancer tissue(，n=36)

表1 LINC00355、miR-494-3p、CCND2在癌旁組織和前列腺癌組織中的表達(，n=36)Tab.1 Expression of LINC00355，miR-494-3p，CCND2 in adjacent tissues and prostate cancer tissue(，n=36)

Note:Compared with adjacent tissues,1)P＜0.001.

Groups LINC00355 miR-494-3p CCND2 mRNA Adjacent tissues 1.00±0.06 0.98±0.04 1.01±0.06 Prostate cancer tissue 2.37±0.081) 0.28±0.031) 2.14±0.071)t 82.000 84.000 73.539 P ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 抑制LINC00355對DU145細胞中miR-494-3p、CCND2表達的影響 與si-NC組相比,si-LINC00355組細胞中miR-494-3p的表達水平顯著升高(P＜0.05),CCND2 mRNA及蛋白表達水平均顯著降低(P＜0.05),見圖2、表3。

2.4 抑制miR-494-3p能減輕抑制LINC00355對DU145細胞增殖、遷移、侵襲的影響 與si-LINC00355+anti-miR-NC組相比,si-LINC00355+anti-miR-494-3p組miR-494-3p的表達水平顯著降低(P＜0.05),細胞增殖抑制率顯著降低(P＜0.05),遷移細胞數與侵襲細胞數顯著增多(P＜0.05),P21、E-cadherin蛋白水平顯著降低(P＜0.05),MMP-2蛋白水平顯著升高(P＜0.05),見圖3、表4。

圖1 抑制LINC00355對DU145細胞中P21、E-cadherin、MMP-2蛋白表達的影響Fig.1 Effect of inhibition of LINC00355 on expressions of P21， E-cadherin and MMP-2 protein in DU145 cells

圖2 CCND2蛋白的表達Fig.2 Protein expression of CCND2

表2 抑制LINC00355對DU145細胞增殖、遷移、侵襲的影響(，n=9)Tab.2 Effect of inhibition LINC00355 on proliferation，migration and invasion of DU145 cells(，n=9)

表2 抑制LINC00355對DU145細胞增殖、遷移、侵襲的影響(，n=9)Tab.2 Effect of inhibition LINC00355 on proliferation，migration and invasion of DU145 cells(，n=9)

Note:Compared with si-NC group,1)P＜0.05.

Groups LINC00355 Inhibition rate(%)Number of migrating cells Number of invasion cells P21 E-cadherin MMP-2 si-NC 1.02±0.06 0.11±0.01 136.00±9.14 86.00±7.42 0.19±0.02 0.24±0.03 0.77±0.05 si-LINC00355 0.35±0.041) 52.26±3.031) 61.00±6.081) 38.00±4.291) 0.65±0.041) 0.76±0.041) 0.29±0.031)t 27.874 51.633 20.496 16.801 30.858 31.200 24.696 P＜0.001 ＜0.05 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.0 01

2.5 miR-494-3p過表達能增強抑制LINC00355對DU145細胞增殖、遷移、侵襲的影響 與si-LINC00355+miR-NC組相比,si-LINC00355+miR-494-3p組miR-494-3p的表達水平顯著升高(P＜0.05),細胞增殖抑制率顯著升高(P＜0.05),遷移細胞數與侵襲細胞數顯著減少(P＜0.05),P21、Ecadherin蛋白水平顯著升高(P＜0.05),MMP-2蛋白水平顯著降低(P＜0.05),見圖4、表5。

表3 抑制LINC00355對細胞DU145中miR-494-3p、CCND2表達的影響(，n=9)Tab.3 Effect of inhibiting LINC00355 on expression of miR-494-3p and CCND2 in DU145 cells(，n=9)

表3 抑制LINC00355對細胞DU145中miR-494-3p、CCND2表達的影響(，n=9)Tab.3 Effect of inhibiting LINC00355 on expression of miR-494-3p and CCND2 in DU145 cells(，n=9)

Note:Compared with si-NC group,1)P＜0.001.

Groups miR-494-3p CCND2 mRNA CCND2 protein si-NC 0.98±0.07 1.00±0.05 0.87±0.06 si-LINC00355 1.71±0.091) 0.31±0.031) 0.42±0.041)t 19.208 35.500 18.721 P ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖3 P21、E-cadherin、MMP-2蛋白的表達Fig.3 Expression of P21，E-cadherin，MMP-2 protein

2.6 LINC00355靶向miR-494-3p及miR-494-3p靶向CCND2 starBase預測顯示LINC00355與miR-494-3p存在結合位點,miR-494-3p與CCND2存在結合位點,見圖5A、B。雙熒光素酶報告實驗結果顯示,轉染野生型載體WT-LINC00355的細胞實驗中,miR-494-3p組熒光素酶活性顯著低于miR-NC組(P＜0.05)；轉染突變型載體MUT-LINC00355的細胞實驗中,miR-494-3p組熒光素酶活性與miR-NC組相比差異無統計學意義(P＞0.05)；轉染野生型載體WT-CCND2的細胞實驗中,miR-494-3p組熒光素酶活性顯著低于miR-NC組(P＜0.05)；轉染突變型載體MUT-CCND2的細胞實驗中,miR-494-3p組熒光素酶活性與miR-NC組相比差異無統計學意義(P＞0.05),見表6。與pcDNA3.1組相比,pcDNA 3.1-LINC00355組細胞中 miR-494-3p的表達水平顯著降低(P＜0.05),見表7。與miR-NC組相比,miR-494-3p組細胞中CCND2 mRNA及蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05)；與anti-miR-NC組相比,anti-miR-494-3p組細胞中CCND2 mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P＜0.05),見圖5C、表8。

圖4 P21、E-cadherin、MMP-2蛋白的表達Fig.4 Expressions of P21，E-cadherin，MMP-2 protein

表4 抑制miR-494-3p能減輕抑制LINC00355對DU145細胞增殖、遷移、侵襲的影響(，n=9)Tab.4 Inhibition of miR-494-3p could reduce inhibitory effect of LINC00355 on proliferation，migration and invasion of DU145 cells(n=9)

表4 抑制miR-494-3p能減輕抑制LINC00355對DU145細胞增殖、遷移、侵襲的影響(，n=9)Tab.4 Inhibition of miR-494-3p could reduce inhibitory effect of LINC00355 on proliferation，migration and invasion of DU145 cells(n=9)

Note:Compared with si-LINC00355+anti-miR-NC group,1)P＜0.001.

Groups miR-494-3p CCND2 Inhibition rate(%)Number of migrating cells Number of invasion cells P21 E-cadherin MMP-2 8±0.04 0.28±0.03 si-LINC00355+anti-miR-494-3p 0.26±0.031)0.78±0.051)18.04±2.011)120±7.881) 71±5.671) 0.25±0.031)0.30±0.031)0.60±0.041)t 37.044 17.493 26.703 17.044 14.492 25.200 28.800 19.200 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.si-LINC00355+anti-miR-NC 0.98±0.05 0.44±0.03 52.35±3.42 63±6.21 37±4.17 0.67±0.04 0.7 001 ＜0.001

表5 miR-494-3p能增強抑制LINC00355對細胞DU145增殖、遷移、侵襲的影響(，n=9)Tab.5 miR-494-3p could enhance inhibitory effect of LINC00355 on proliferation，migration and invasion of cell DU145(，n=9)

表5 miR-494-3p能增強抑制LINC00355對細胞DU145增殖、遷移、侵襲的影響(，n=9)Tab.5 miR-494-3p could enhance inhibitory effect of LINC00355 on proliferation，migration and invasion of cell DU145(，n=9)

Note:Compared with si-LINC00355+miR-NCgroup,1)P＜0.001.

Groups miR-494-3p CCND2 Inhibition rate(%)Number of migrating cells Number of invasion cells P21 E-cadherin MMP-2 5 0.30±0.03 si-LINC00355+miR-494-3p 1.68±0.081)0.15±0.021)77.19±4.231) 40±3.581) 24±2.361) 0.92±0.051)1.03±0.061)0.12±0.021)t 20.700 23.297 13.600 11.683 10.434 12.182 9.987 14.977 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.si-LINC00355+miR-NC 0.99±0.06 0.43±0.03 51.98±3.61 62±4.37 39±3.61 0.66±0.04 0.77±0.0 001 ＜0.001

圖5 LINC00355、miR-494-3p、CCND2之間的靶向關系Fig.5 Targeting relationship between LINC00355，miR-494-3p，CCND2

表6 雙熒光素酶報告實驗(，n=9)Tab.6 Dual luciferase reporter experiment(，n=9)

表6 雙熒光素酶報告實驗(，n=9)Tab.6 Dual luciferase reporter experiment(，n=9)

Note:Compared with miR-NC group,1)P＜0.001.

Groups WTLINC00355 MUTLINC00355 WTCCND2 MUTCCND2 miR-NC 0.93±0.06 0.94±0.06 1.01±0.05 0.99±0.06 miR-494-3p 0.35±0.041)0.97±0.06 0.28±0.031)0.97±0.06 t 24.130 1.061 37.558 0.707 P ＜0.001 0.305 ＜0.001 0.489

表7 LINC00355調控miR-494-3p的表達(n=9)Tab.7 LINC00355 regulated expression of miR-494-3p(，n=9)

表7 LINC00355調控miR-494-3p的表達(n=9)Tab.7 LINC00355 regulated expression of miR-494-3p(，n=9)

Note:Compared with pcDNA3.1 group,1)P＜0.001.

Groups miR-494-3p pcDNA3.1 0.96±0.06 pcDNA3.1-LINC00355 0.38±0.041)t 24.130 P ＜0.001

表8 miR-494-3p調控CCND2的表達(，n=9)Tab.8 miR-494-3p regulated expression of CCND2(，n=9)

表8 miR-494-3p調控CCND2的表達(，n=9)Tab.8 miR-494-3p regulated expression of CCND2(，n=9)

Note:Compared with miR-NC group,1)P＜0.001；compared with antimiR-NC group,2)P＜0.001.

Groups CCND2 mRNA CCND2 protein miR-NC 0.98±0.06 0.80±0.04 miR-494-3p 0.27±0.031) 0.33±0.031)anti-miR-NC 0.96±0.06 0.81±0.04 anti-miR-494-3p 1.66±0.082) 1.23±0.062)F 632.221 621.337 P ＜0.001 ＜0.001

3 討論

前列腺癌細胞增殖及轉移能力增強可降低治療效果及影響患者生活質量,研究表明LncRNA在前列腺癌組織或細胞中表達升高或降低,并可通過影響前列腺癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲從而發揮癌基因或抑癌基因的作用[7-9]。但仍有部分LncRNA在前列腺癌發生及發展過程中的調控機制尚未闡明。

LINC00355在膀胱癌、肺腺癌等腫瘤中表達上調,并可促進腫瘤細胞增殖及侵襲,還可作為臨床診斷指標[10-12]。與上述研究結果相似,本研究結果顯示LINC00355在前列腺癌組織中呈高表達,抑制其表達可明顯降低前列腺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力。提示LINC00355在前列腺癌發生及發展過程中可能發揮癌基因的作用,抑制LINC00355表達可減弱前列腺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力。研究表明P21可負向調控細胞周期,抑制細胞增殖[13]。相關報道指出上皮-間質轉化(EMT)與腫瘤細胞轉移能力密切相關,其中E-cadherin是EMT上皮表型標志物,其表達量降低可促進EMT的發生進而促進細胞遷移及侵襲。MMP-2屬于基質金屬蛋白酶類,可通過降解細胞外基質沉積從而促進細胞轉移[14]。本研究結果顯示抑制LINC00355表達后,前列腺癌細胞中P21、E-cadherin表達量升高,MMP-2表達量降低,提示抑制LINC00355表達可能通過上調P21、E-cadherin表達及下調MMP-2表達從而抑制前列腺癌細胞增殖、遷移及侵襲。

miR-494-3p表達量降低可促進肝細胞癌、口腔鱗狀細胞癌發生及發展[15-16]。本研究結果顯示miR-494-3p在前列腺癌組織中表達量降低,進一步研究顯示抑制miR-494-3p表達可明顯促進前列腺癌細胞增殖、遷移及侵襲,說明抑制miR-494-3p表達可減弱抑制LINC00355對DU145細胞增殖、遷移侵襲的影響。同時,miR-494-3p過表達可明顯降低前列腺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力,說明miR-494-3p過表達可增強抑制LINC00355對DU145細胞增殖、遷移、侵襲的影響。提示LINC00355可能通過下調miR-494-3p表達從而促進前列腺癌發生及發展。研究表明LncRNA H19與CCND2競爭性結合miR-29c-3p從而促進膀胱癌發生及發展[17]。相關報道指出CCND2在宮頸癌中表達量升高,并可促進宮頸癌發生及發展[18]。本研究結果顯示CCND2在前列腺癌組織中表達量升高,與上述研究結果相似,提示CCND2在前列腺癌發生過程中可能發揮癌基因作用。本研究結果顯示前列腺癌細胞中抑制LINC00355表達后可明顯促進miR-494-3p表達、抑制CCND2表達,提示抑制LINC00355表達可能通過調控miR-494-3p/CCND2分子軸從而發揮作用。同時本研究結果證實LINC00355可靶向結合miR-494-3p,miR-494-3p可靶向結合CCND2,LINC00355可負向調控miR-494-3p的表達,miR-494-3p可負向調控CCND2的表達,提示LINC00355可作為競爭性內源RNA而抑制miR-494-3p表達從而間接上調CCND2的表達。

綜上所述,LINC00355與CCND2在前列腺癌發生及發展過程中可作為癌基因,二者可競爭性結合miR-494-3p從而促進前列腺癌細胞增殖、遷移及侵襲,LINC00355可能作為前列腺癌靶向治療的潛在靶點,并為臨床前列腺癌的診斷及治療提供新方向。