“小鼠胸腺T淋巴細胞亞群及其凋亡檢測”整合實驗的建立與初探①

徐 勇 馬正邦 葉黃河 羅偉東 鄭沛翔 耿二朔 曹 璨 譚 政 梁智輝華中科技大學同濟醫學院基礎醫學院細胞分子生物實驗中心武漢430030

傳統的免疫學實驗教學內容的設計或因實驗技術和理念問題,多采用一個實驗僅針對單一知識點與現象,通過側重講解實驗原理、操作流程與實驗結果,以加深學生對這個知識點與現象的理解與認識[1]。如華中科技大學同濟醫學院免疫學實驗“流式細胞術檢測T細胞亞群”針對免疫細胞亞群等知識點,“DNA Ladder檢測胸腺細胞凋亡”則針對胸腺細胞經藥物誘導的細胞凋亡現象知識點。而鮮有通過一個實驗同時展示多個且相互間有聯系的知識點。2019年教育部教高[2019]6號文件中指出要加強課程體系整體設計,提高課程建設規劃性、系統性,避免隨意性、碎片化[2]。同時,受突發疫情影響,各類學校推遲學生返校,為響應教育部“停課不停學”號召,全國高等院校均開展了理論課網上直播教學,并取得了顯著成效；雖然實驗課也開展了虛擬實驗教學或家庭實驗模式,但并不能取代原實驗課教學。在后疫情時期復學后,各地高校將面臨實驗課補課與實驗資源嚴重不足之矛盾,適當壓縮、調整實驗課程課時與內容是可選手段之一。為此,本研究擬建立“五色流式細胞術同時檢測小鼠胸腺淋巴細胞亞群與細胞凋亡”的實驗方法,用于建立“淋巴細胞亞群及其凋亡”的整合實驗,以期達到從學科內部改進整合與創新型免疫學實驗教學內容,亦可作為后疫情時期對實驗課進行調整壓縮的手段之一,保障“教學標準不降低,教學質量不打折”。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI1640培養基購自Gibco公司；胎牛血清(56℃,30 min滅活后使用)購自杭州四季青公司；昆明小鼠由同濟醫學院實驗動物中心提供；LSR-Ⅱ流式細胞儀為BD公司產品,由華中科技大學同濟醫學院細胞工程平臺提供。抗鼠CD3-BV510、CD4-BV421、CD8-FITC抗體購自Biolegend公司；細胞凋亡試劑盒(Annexin-V-APC/PI)購自Bender Medsystems公司。

1.2 方法

1.2.1 胸腺細胞制備 取4～6周小鼠,頸椎脫位處死,無菌取胸腺,置于盛有不完全培養液的平皿中,洗滌去血跡、放入160目篩網上研磨,邊磨邊加RPMI1640培養液5 ml,獲取單個胸腺細胞懸液,離心沉淀后用5 ml PBS洗滌1次,加入不完全RPMI1640培養液調整細胞濃度為2×106個/ml,備用；

1.2.2 樣本管設置與編號 每個學生小組取9支流式管并編號1～9號,設置空白管(1號)、補償對照管(2～6號)、Annexin-V、PI的FMO對照管(7～8號)與實驗管(9號),各管分別加入上述制備的胸腺細胞0.5 ml,加入PBS 2 ml,離心洗滌1次,去上清,90μl PBS重懸。

1.2.3 流式抗體稀釋、混合與分裝 由于流式抗體用量非常微量(0.25～1μl)且昂貴,為方便學生精確加樣,減少取樣過程中的損耗,參照抗鼠CD3、CD4、CD8熒光抗體說明書推薦用量或滴定用量,計算實驗所需總量,按照稀釋后10μl/樣本抗體使用量,用PBS分別稀釋后分裝至小EP管中,10μl/管,備用；抗鼠CD3/CD4/CD8混合熒光抗體則需先將3種熒光抗體混合后,再用PBS稀釋后并分裝,10μl/管,備用。

1.2.4 T細胞亞群免疫熒光染色 1號管加10μl PBS,2～4號分別加入抗鼠CD3、CD4、CD8熒光抗體10μl,5～6號加10μl PBS,7～9號加入抗鼠CD3/CD4/CD8混合熒光抗體10μl,4℃ 孵育30 min后,加PBS 2 ml,洗滌1次(1 500 r/min,6 min),去上清。

1.2.5 細胞凋亡染色(Annexin-V-APC/PI) 用100μl結合緩沖液懸浮各管細胞,5號、7號、9號管加入5μl Annexin-V-FITC,混勻,避光室溫孵育10 min后,6號、8號、9號再加5μl PI,混勻,避光室溫作用10 min。最后各管補充結合液300μl,1 h內上流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 流式細胞術檢測實驗結果 按流式細胞儀操作常規,由實驗教師依次調節空白管、補充對照管、FMO對照的各參數并設置好熒光補償,應用LSR-Ⅱ型流式細胞儀FACSdiva軟件獲取20 000～50 000個細胞,并進行結果分析。實驗結果的檢測與分析過程由實驗老師邊操作邊簡單講解,同學觀摩。

2.2 流式數據分析

2.2.1 胸腺T細胞及其亞群分析方法 胸腺T細胞及其亞群數據分析作圖方法如圖1A～C所示,參照補償對照、FMO對照管的熒光信號進行界定,并顯示T細胞及其亞群所占比例。

2.2.2 胸腺T細胞及其亞群細胞凋亡數據分析方法 胸腺T細胞及其亞群細胞凋亡的分析作圖方法如圖1A～H所示,參考FMO對照管信號進行界定,并顯示CD3+細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+CD8+T細胞、CD4-CD8-細胞凋亡比例。

3 新方法在醫學免疫學整合實驗中的應用與比較

通過招募征集到華中科技大學同濟醫學院醫學實驗技術班志愿者,嘗試開設了整合實驗課“小鼠胸腺T淋巴細胞亞群及其凋亡檢測”,按傳統免疫學實驗課方式進行小范圍授課,并與傳統實驗課進行了比較(表1)。

4 討論

圖1 五色流式細胞術同時檢測淋巴細胞亞群及其凋亡的結果分析Fig.1 Analysis of lymphocyte subsets and their apoptosis simultaneously detected by five-color flow cytometry

表1 新整合實驗與兩個傳統實驗的比較Tab.1 Comparison between new integration experiment and two traditional experiments

流式細胞術是應用流式細胞儀,對處于快速、呈直線流動狀態中的單列細胞或顆粒性物質進行逐個、多參數、定性/定量分析或分選的一種檢測技術,經過約半個世紀的發展,已成為現代生命科學研究和臨床醫學檢驗不可或缺的重要技術,并且已廣泛地應用于免疫學理論研究、臨床實踐和基礎醫學實驗教學中[3-4]。淋巴細胞分類及其亞群、細胞凋亡均為免疫學中重要的教學內容與知識點。通過流式細胞術鑒定細胞分化群(CD分子)將淋巴細胞進行分類、分亞群是簡便、快捷、敏感、精確的重要技術手段[4]。細胞凋亡是生物體內一種普遍存在的現象,它貫穿于機體的整個生命過程,從胚胎形成、新舊細胞交替,前T淋巴細胞清除,到某些組織的正常退化、萎縮與增生及腫瘤細胞的抑制等過程[4]。細胞凋亡檢測主要是利用細胞凋亡形態學特點和生化特征來進行的。細胞凋亡的典型形態學可通過光學顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡觀察。利用細胞凋亡時染色質或DNA斷裂的生化特征,運用電泳技術可檢測到核染色體DNA片段化的“梯狀”電泳圖譜即DNA Ladder[5]。利用流式細胞分析術,通過凋亡細胞磷脂酰絲氨酸(PS)膜翻轉原理檢測細胞凋亡是目前凋亡細胞檢測最為常用的技術方法之一,如Annexin-V/PI、Annexin-V/7-AAD雙染法等。

華中科技大學同濟醫學院在醫學本科生和研究生免疫學實驗課程中開設了“流式細胞術檢測T細胞亞群”和“DNA Ladder檢測胸腺細胞凋亡”兩項實驗。本實驗所建立的“五色流式細胞術同時檢測淋巴細胞亞群及其凋亡”方法,通過其實驗過程、分析方法與結果解讀,不僅可清楚地顯示胸腺細胞中CD4-CD8-T細胞、CD4+CD8+T細胞、CD4+T細胞與CD8+T細胞的比例,也能觀察到生理狀況下細胞在發育過程中經過“陽性選擇/陰性選擇”所經歷的細胞凋亡事件,完全適用于將淋巴細胞亞群與細胞凋亡實驗整合為一個實驗教學內容。

本團隊還通過模擬開設新整合實驗課“小鼠胸腺T淋巴細胞亞群及其凋亡檢測”并與傳統實驗課進行了比較。新整合實驗課所用課時只有3個學時,與分別開設的兩個傳統實驗比較減少了3個學時；其所涉及的知識點與現象多達6個,明顯多于分別開設傳統實驗,且相互間也不再是單一的、孤立的、片面的,而是相互間有聯系的、整體的、多個知識點與現象。

綜上所述,該新方法的建立非常有利于加強課程體系整合設計與創新,是立足學科內部對相關性實驗進行整合與創新的較好嘗試；亦可作為后疫情時期對實驗課進行壓縮、調整的手段之一,減少實驗課補課的壓力,保障“教學標準不降低,教學質量不打折”,助力創新型人才培養。