舍曲林對CUMS抑郁癥大鼠的保護作用及其機制研究①

岳凌峰 仲照希 馬 敬 王 寧 新鄉醫學院第二附屬醫院精神四科新鄉453002

抑郁癥是一種廣泛分布的衰弱性疾病,每年有超過3.5億人口受抑郁癥的影響[1]。抑郁癥患者常伴有情感性精神障礙,情緒持久低落并且對事物缺少興趣,還伴有體重的顯著變化、睡眠時長急劇縮減、精神亢奮或者萎靡等癥狀,嚴重者甚至產生自殺的念頭或行為等[1]。由世界精神病協會近期發表的數據顯示,抑郁癥發病率每年以113%的速度急劇遞增。隨著分子生物學和細胞生物學技術的不斷進步,抑郁癥的病理生理學相關機制研究也取得了突飛猛進的進展。目前國內外諸多研究證實氧化應激反應和炎癥反應均在抑郁癥疾病發生發展中起到關鍵作用。相關動物實驗表明,炎癥因子能誘導動物產生抑郁癥相關癥狀的行為,當給動物進行LPS和IL-1β刺激時,能誘導大鼠產生抑郁樣行為[2]。炎癥細胞因子經外周神經損傷誘導而過量表達時也有動物抑郁樣的表現[3-4]。臨床實驗還證明抑郁癥患者體內的MDA和SOD水平顯著高于常人,但經過藥物治療之后,便可以降低至正常水平[5-6]。舍曲林(sertraline,STL)又名左洛復,是一種選擇性血清素再吸收抑制劑類抗抑郁藥物。起初即被用來治療重度抑郁癥、強迫癥、恐慌癥和社交焦慮癥等[7]。STL是目前最具潛力和最重要的五羥色胺抑制劑藥物之一,對重度抑郁癥具有非常好的效果[8-9]。有文獻報道,STL可以有效降低血清中IL-6、TNF-α的表達水平,同時還可以上調抑炎因子IL-10表達,通過抑制體內炎癥的方式來治療抑郁癥[10]。另外,RAWDIN等[11]研究報道,在重度抑郁癥患者當中,氧化應激標志物F2-lsoPs的表達量與IL-6的表達水平呈正相關性。說明氧化應激反應在抑郁癥患者的發病機制中占有重要地位。本研究根據前人科研成果,探究STL在大鼠CUMS抑郁癥模型中,對炎癥反應和氧化應激的效果和作用機制,期望為抑郁癥的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 ICAM-1(貨號:ab171123)、Caspase-3(貨 號:ab13847)、Caspase-9(貨 號:ab202068)、GAPDH(貨號:1056)一抗及BDNF(貨號:ab99978)試劑盒購自美國Abcam公司。HRP標記的山羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司。IL-4(貨號:EEL-R0014)、IL-10(貨號:E-EL-R0016)、SOD(貨號:E-EL-R1424)、MDA(貨號:E-EL-0060)、LDH(貨號:E-EL-R2547)、IL-1β(貨號:E-EL-M0037c)和IL-6(貨號:E-EL-R0015c)等ELISA試劑盒購自Elabscience。Click-iT?Plus TUNEL assay試劑盒(貨號:C10618)購自Invitrogen公司。

1.1.2 儀器 半干轉膜儀、電泳儀以及PCR儀均購于美國伯樂公司。Multiskan GO酶標儀購自Thermo。Gel View 6000化學發光凝膠成像儀購自廣州云星儀器有限公司。分析天平ME204購自梅特勒托利多國際貿易(上海)有限公司。生物安全柜HR30-IIA2、-86℃超低溫冰箱DW-86L578J、-25℃低溫保存箱DW-25L262h和2～8℃醫用冷藏箱HYC-310購自海爾公司。Eppendorf臺式冷凍離心機5702R購自德國艾本德股份公司。

1.1.3 實驗動物 60只Sprague Dawley(SD)大鼠來源于中國科學院實驗動物中心,雄性,平均體重250～280 g,4～6周齡。

1.2 方法

1.2.1 大鼠抑郁癥模型建立 實驗前1周,大鼠可以自由獲得食物和水來適應環境。溫度22℃左右,相對濕度約55%～60%,12 h晝夜交替進行適應性飼養。以體重、日攝食量、糖濃度、自發性運動距離5 min為基線最后將得分最接近的40只大鼠納入后續實驗,隨機平均分為對照組和抑郁模型組(n=20)。對照組大鼠正常飼養,密度為5只/籠。抑郁模型組大鼠飼養密度為1只/籠,采用Willner報道的方法構建抑郁模型。模型組大鼠受到13種類型的刺激,包括顛倒白天/黑夜(24和48 h)、重復45°傾斜鼠籠(每隔4、12和24 h)、斷水(6～12 h)、缺食物(12～24 h)、噪音(金屬沖突2 h和大鼠大聲叫嚷2 h)、濕墊、外來異物、無墊(6 h)、尾巴夾緊(輕微)、同籠、水平振動、籠子交換和喂養環境變化。每只大鼠每天只接受一種方法的刺激,并在籠子里單獨飼養35 d。從第4周開始,觀察總指標(體重、飲料量和食物量)、糖水攝入量百分比和曠場運動行為。大鼠分為4組:對照組(cTRL)、加藥組(STL,20 mg/kg,body weight)、模型組(CUMS)、治療組(STL+CUMS)[12]。

1.2.2 大鼠基本指標檢測 各組處理過程中觀察記錄大鼠對蔗糖偏好。讓大鼠習慣于飲用兩瓶1%蔗糖溶液24 h,第二天用清水更換其中一瓶蔗糖溶液。經過24 h后禁食、禁水后,允許大鼠飲用1%的蔗糖溶液(100 ml)和等量的水3 h。蔗糖偏好=蔗糖水消耗量/(純水消耗量+蔗糖水消耗量)×100%蔗糖水的體積。處理結束后稱量各組大鼠體重,提取大鼠血清,以備后續處理。

1.2.3 ELISA檢測炎癥因子 大鼠心內取血1 ml,低溫離心機4 000 r/min離心8 min,取出上清液供實驗使用。加樣設置:分別設空白孔、標準品孔、待測樣品孔。酶標包被的板子上加標準品50μl,先加入樣品稀釋液40μl于待測樣品孔,然后加待測樣品10μl。孵育:封板后37℃孵育30 min。液體配置:把30倍洗滌母液經蒸餾水稀釋30倍留著備用。洗滌:緩慢揭掉封板膜,將液體棄去,甩干液體,每孔加洗滌液,放置30 s之后棄去,反復重復5次,拍干板子。加酶:每孔加酶標試劑50μl,空白孔不加。孵育:再次封板后37℃孵育30 min。洗滌:小心取掉封板膜,甩干液體,每孔加適量洗滌液,放置30 s之后棄去,反復重復5次,拍干板子。顯色:各孔加入顯色劑A液50μl,再加顯色劑B液50μl緩慢震蕩混勻后,37℃避光進行顯色10 min。終止:各孔加入50μl終止反應液,反應終止(終止后藍色立即轉為黃色)。測定:用空白孔進行調零,450 nm波長下依次測量每孔吸光值(OD值)。測定應在加入終止液后的15 min內進行。

1.2.4 免疫組織化學法分析組織中抗原表達 將組織從-86℃冰箱取出后用PBS緩沖液清洗8次,去掉壞死組織和血凝塊。4%多聚甲醛于4℃固定24 h。PBS緩沖液清洗3次,再用30%、50%和70%酒精依次清洗。脫水,石蠟包埋。1%Triton-100進行處理15 min,3%H2O2處理15 min。5%的羊血清封閉30 min后,依次孵育一抗及二抗。染色封片。

3.全面性原則。綜合素質測評要全面反映習近平總書記提出的要求，能夠從多個方面、多個層次和多個角度深入刻畫學生的綜合素質狀態。全面性要求詳細刻畫學生的德育、體育和專業能力，指標并不是越多越好，而是要客觀描述學生綜合素質的靜態和動態特征。

1.2.5 TUNEL檢測細胞凋亡 將裸鼠處死后腫瘤組織經過石蠟包埋,二甲苯中脫蠟10 min,換用新鮮二甲苯,再脫蠟10 min,無水乙醇5 min,90%乙醇2 min,70%乙醇2 min,蒸餾水2 min。滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K用P0106免疫染色洗滌液室溫作用30 min。PBS洗滌3次。配制適當量TUNEL檢測液滴加樣品上,37℃避光孵育60 min。洗滌后用抗熒光猝滅封片液封片后顯微鏡下(激發波長范圍為450～500 nm)觀察。

1.2.6 Western blot檢測細胞中蛋白表達 收集細胞,PBS清洗3次,用添加有終濃度為1 mmol/L的蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)的細胞裂解液進行裂解,提取各組細胞總蛋白。用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度(具體檢測按照試劑說明書進行),10%SDS-PAGE膠分離蛋白后用半干轉膜儀轉移蛋白質至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h,隨后加入一抗于4℃封閉過夜,第二天加入對應二抗室溫封閉1 h,最后滴加ECL曝光顯影。SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜,經5%BSA封閉后依次孵育相應一抗和二抗。顯色并統計灰度值計算相對表達量。

1.3 統計學分析 所有實驗數據均使用統計學軟件SPSS19.0進行統計分析,實驗結果以表示。方差齊且服從正態分布則組間比較用One-Way ANOVA。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CUMS誘導建立抑郁癥大鼠模型 CUMS誘導建立抑郁癥大鼠模型后,體重指標顯示:相較于健康cTRL組大鼠,STL組大鼠體重無顯著差異,而模型CUMS組大鼠體重則顯著下降(P＜0.01,圖1A)；與CUMS組比較,CUMS+STL組大鼠體重發生明顯上調(P＜0.01,圖1A)。蔗糖偏好實驗檢測結果顯示:相較于健康cTRL組大鼠,單獨加藥組大鼠對蔗糖偏好無顯著差異,而模型CUMS組大鼠則對蔗糖偏好發生顯著下降(P＜0.01,圖1B)；與CUMS組比較,CUMS+STL組大鼠對蔗糖偏好發生明顯上調(P＜0.01,圖1B)。如圖1C所示,CUMS組5-HT濃度明顯下降,而STL可以逆轉5-HT濃度明顯下降(P＜0.01,圖1C)。

2.2 STL改善大鼠體內炎癥因子水平 ELISA檢測血清中相關促炎癥因子IL-6、IL-1β和抗炎因子IL-4、IL-10等,結果顯示:與正常cTRL組比較,STL組促炎因子和抗炎因子表達水平均無顯著差異；CUMS模型組促炎因子IL-6和IL-1β顯著上升,而抗炎因子IL-4和IL-10則顯著下降(P＜0.01,圖2A、B)；相較于CUMS模型組,CUMS+STL組大鼠IL-6和IL-1β水平有明顯下調,而IL-4和IL-10水平顯著升高(P＜0.01,圖2A、B)。同時,在腦脊液中,與正常cTRL組比較,STL組IL-6和IL-4表達水平均無顯著差異；CUMS模型組IL-6顯著上升,而IL-4顯著下降(P＜0.01,圖2C)；相較于CUMS模型組,CUMS+STL組大鼠IL-6水平有明顯下調,而IL-4水平顯著升高(P＜0.01,圖2C)。

圖1 STL對CUMS抑郁癥模型大鼠癥狀的影響Fig.1 Effects of STL on rat model of CUMS

2.3 STL降低抑郁癥大鼠腦組織中ICAM-1表達免疫組化實驗顯示,與cTRL組相比較,STL組大鼠腦組織中ICAM-1表達水平無顯著差異；而CUMS模型組表達水平急劇升高(P＜0.01,圖3)；與CUMS模型組比較,CUMS+STL組大鼠腦組織中ICAM-1的表達水平顯著下降(P＜0.01,圖3)。

2.4 STL改善抑郁癥大鼠血清中氧化應激相關分子含量 ELISA檢測血清中氧化應激相關因子SOD、MDA和LDH,結果顯示:相較于cTRL組,STL組三者表達水平無顯著差異；但CUMS模型組中SOD表達水平明顯降低,而MDA和LDH表達則顯著上升(P＜0.01,圖4)；與CUMS模型組相比,CUMS+STL組SOD水平顯著上調,且MDA和LDH水平顯著下調(P＜0.01,圖4)。

圖3 免疫組化檢測大鼠腦組織中ICAM-1表達水平Fig.3 Expression of ICAM-1 was detected with immunohistochemical method in rat brain tissues

圖4 ELISA檢測血清中氧化因子表達水平Fig.4 Expression of oxidative-related factors were detected with ELISA in serum

圖5 TUNEL染色鑒定細胞凋亡及Western blot檢測各處理凋亡相關基因表達水平(×200)Fig.5 Activation of apoptosis and apoptosis-related factors were detected in rat brain tissue by TUNEL staining and Western blot(×200)

3 討論

世界精神病協會最近發表的數據表明,抑郁癥發病率以每年113%的高速度進展。其中重度抑郁癥已發展成全球第五大致殘因素[13]。有研究發現,當下我國抑郁癥患者終生患病率大約為3.3%[14]。逐漸增加的抑郁癥患者不僅給個人和家庭帶來痛苦和負擔,同時也給社會帶來很多問題和影響[15]。伴隨著分子生物學和細胞生物學技術不斷進步,抑郁癥相關的病理生理學機理研究也獲得巨大突破。抑郁癥發病機制除了與遺傳因素相關外,目前諸多研究表明氧化應激和炎癥反應在抑郁癥的發生發展中起到巨大作用[16]。

深入研究抑郁癥發病機理對控制抑郁癥發展具有重大意義。當前的研究顯示,抑郁癥患者體內中樞神經系統、神經內分泌系統、免疫系統等功能均有不同程度的病理性改變,由此產生氧化應激和炎癥反應假說、單胺假說、免疫系統異常假說、神經遞質受體假說、神經內分泌功能假說等[14-17]。其中炎癥反應和氧化應激假說逐漸受到人們的重視,此假說主要觀點為:機體受到應激后,原有的氧化還原平衡被打破,相應的抗氧化酶功能產生異常,ROS表達過量,導致釋放大量促炎癥因子,產生嚴重的炎癥反應,進一步引起神經細胞內重要生物大分子結構和功能紊亂,進而促進抑郁癥發生[18-19]。本研究發現STL可以有效緩解CUMS模型組大鼠氧化應激反應和炎癥反應。

現有大量研究證實STL具有抗炎、抗氧化等特性。ABDEL等[20]報道STL可以通過降低過氧化氫酶和PON1的活性來減少大腦氧化損傷。STL可以降低慢性心力衰竭患者體內細胞質中氧化應激標志物MDA的表達水平,并有效降低患者抑郁傾向[21]。同時,STL還可以降低慢性心力衰竭合并重度抑郁癥患者體內炎癥因子的表達水平,有效改善患者抑郁癥狀[22]。本研究結果表明,在對CUMS大鼠模型進行STL治療后,有效降低大鼠體內氧化應激產物MDA和LDH等表達,并促進SOD上調以應對大鼠氧化應激反應；同時經過STL治療后CUMS大鼠體內大量促炎癥因子IL-6和IL-1β等顯著下調,并促進抑炎因子IL-10和IL-4等上調。表明STL在大鼠抑郁癥模型中可以有效抑制炎癥和氧化應激反應。

已報道STL具有抗炎和抗氧化應激效用,本研究在CUMS誘導的大鼠抑郁癥模型中證實,STL可以有效降低大鼠血清中ICAM-1和IL-6、IL-1β等相關炎癥因子,并且能夠提高IL-4和IL-10水平,說明STL可以有效抵抗炎癥因子的作用。腦脊液中,各組大鼠IL-6水平表現出比血清更明顯的變化,而IL-4在腦脊髓和血清中水平相當,說明IL-6水平在STL誘導的CUMS抑郁癥減輕其關鍵作用。文獻報道這些促炎癥因子可以激活細胞內NF-κB/ICAM-1途徑,而ICAM-1可以在炎癥部位促進細胞黏連性[23-24]。經過免疫組化實驗證實當抑郁癥模型大鼠經過STL治療后,腦組織中ICAM-1表達水平顯著下調。也有文獻證明IL-10可以通過STAT3磷酸化從而抑制IL-6、IL-1β和TNF-α表達,抑制炎癥反應[25-28]。同時,在抗氧化應激方面,IL-4可以有效增加SOD含量,減少MDA和LDH表達,說明細胞可以有效應對氧化應激(SOD升高),減少氧化應激水平(MDA降低),同時細胞活性增加(LDH降低)[5-6]。

同時,有部分文獻報道在抑郁癥患者體內持續的慢性炎癥最終會發展成為細胞凋亡,造成神經細胞降解,改變大腦結構[29-30]。針對抑郁癥患者自身氧化應激反應產生的氧化自由基同時也會促進細胞內蛋白質、核酸等生物大分子降解,從而誘導細胞發生凋亡[31-32]。本研究通過TUNEL染色發現CUMS大鼠模型組大腦組織細胞發生嚴重的凋亡現象,在經過STL治療后凋亡現象得到明顯改善。同時利用Western blot技術也檢測到STL治療后大鼠腦組織細胞凋亡程度得到良好改善。說明,在抑郁癥大鼠大腦組織內伴隨著炎癥和氧化應激的同時,還有腦細胞凋亡發生。

綜上所述,STL對抑郁癥大鼠具有一定治療效果,其發揮作用的機制可能是通過STL抑制CUMS大鼠體內炎癥、氧化應激和凋亡來實現。STL治療可以有效降低大鼠體內炎癥因子表達量；同時又可以增加抑炎因子表達并有效抑制大鼠體內氧化應激產物的水平,且對腦細胞凋亡有一定的緩解作用。說明STL在大鼠抑郁癥模型中具有一定治療效果,為抑郁癥臨床治療提供借鑒。