通過式固相萃取/UPLC-MS/MS測定小麥粉及其添加劑中非食用物質三聚硫氰酸三鈉鹽

張艷俠，尹麗麗，薛 霞，徐向軍，趙慧男，王 駿， 張 卉，劉艷明*，祝建華*

(1.山東省食品藥品檢驗研究院 山東省特殊醫學用途配方食品質量控制工程技術研究中心 山東省食品 藥品安全檢測工程技術研究中心，山東 濟南 250101；2.中國石化天然氣分公司 榆濟管道公司， 山東 濟南 250101)

三聚硫氰酸三鈉鹽(TMT)為一種重金屬離子處理劑，通過鈉離子與重金屬離子的交換而形成穩定的化合物沉淀出來，達到去除重金屬離子的目的[1-2]。因其對傳統堿中和方法不能去除的重金屬離子具有很好的去除效果而得到廣泛應用[3-5]。TMT化學名為1,3,5-三嗪-2,4,6(1H,3H,5H)-三硫醇三鈉鹽，極易溶于水，其酸的形式為三聚硫氰酸(Trithiocyanuric acid,H3TMT)，水溶性差，主要用途為丙烯酸酯橡膠專用硫化劑及銅礦的浮選藥劑等[6-8]。三聚硫氰酸及其鈉鹽均為化工用品，屬于非食用物質，對水系統易產生危害，不允許大量接觸地下水或城市用水系統。隨著工業廢水的大量排放，重金屬污染的日益加劇，TMT在含重金屬廢水處理中的廣泛應用帶來了嚴重安全隱患[9-11]。作為大宗消費品，小麥及其制品的質量安全風險主要來源有本底污染、生物污染、化學污染、加工工藝的影響及違規使用添加劑或非法添加等[12-14]。近期有稽查機構查處了部分違禁小麥粉，其中含有非食用物質TMT，因此亟需加強小麥粉及其相關產品中TMT的監測。

TMT的研究主要集中在重金屬污水處理方面，缺乏檢測方法研究。對于小麥粉及其添加劑中TMT的檢測方法未見報道且無相關檢測標準。有文獻分別利用酸堿滴定法和紫外分光光度法檢測燃煤電廠脫硫廢水中TMT含量[15]，該方法定性定量差，為常量檢測。也有利用高效液相色譜法檢測橡膠助劑H3TMT的報道，但該方法只針對標準品進行分析，不涉及前處理[16]。TMT與H3TMT互為共軛酸堿，H3TMT為三元酸，有3個離解常數，在水中可電離產生H3TMT、H2TMT-、HTMT2-和TMT3-4種形式[17]，因此有效地提取和測定TMT總含量是關鍵。基質方面，小麥粉添加劑包括玉米淀粉、各種鹽、酶制劑等成分，分為鹽式處理劑(FTA1)和酶式處理劑(FTA2)[18-20]。其中前者主要含有各種礦物質鹽和維生素C等營養元素，水溶性好；后者以食用玉米淀粉、淀粉酶等復合酶為主，基質較復雜，遇水易成膠狀，提取難度大。小麥粉及其添加劑常用的凈化技術有固相萃取法、基質固相萃取法及免疫親和柱法等[21-25]，前兩者的凈化能力不足且操作復雜，免疫親和柱的適用范圍小。Oasis PRiME HLB為通過型固相萃取柱，能有效去除磷脂、蛋白、油脂、色素及鹽等雜質，已被用于肉及肉制品、水產品、禽副產品等中獸藥殘留的檢測[26-29]。

本研究建立了小麥粉及其添加劑中三聚硫氰酸三鈉鹽總量的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。優化的乙腈-甲酸/甲酸銨緩沖溶液提取體系不僅能有效提取TMT的各種形式，還能很好地分散各種類型的面粉添加劑；通過式Oasis PRiME HLB固相萃取柱無需活化和洗脫步驟，操作簡單，可有效去除干擾，降低基質效應。該方法簡便快捷，靈敏度高，重現性好，檢測效率高，適用于小麥粉及其添加劑中三聚硫氰酸三鈉鹽總量的定性、定量檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290 Infinity Ⅱ液相色譜和Agilent 6470三重四極桿液質聯用系統，配噴射流電噴霧(Jet ESI)電離源，使用Agilent MassHunter采集軟件(B.08.00版)和Agilent MassHunter定量分析軟件(B.07.00 版)進行數據采集和分析(美國Agilent公司)。Sigma 3-18K高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；超聲波清洗器(寧波新芝生物科技有限公司)；MS3渦旋混合器(IKA公司)，N-EVAP-45位氮吹儀(美國Organomation公司)；SQP-電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；Milli-Q超純水儀。

實測樣品來自市場購買及稽查樣品。三聚硫氰酸三鈉鹽標準品(純度≥98.3%,阿爾塔公司)，避光保存；甲醇、乙腈(色譜純，德國默克公司)；甲酸(FA)、甲酸銨(NH4FA)、醋酸銨(色譜純，美國Sigma-Aldrich公司)；實驗用水為超純水；氮氣(>99.999%)；固相萃取柱：Oasis PRiME HLB(200 mg/6 mL)，有機微孔濾膜(0.22 μm,上海安譜科學儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制準確稱取10 mg(精確至0.01 mg)TMT標準品，用甲醇溶解后定容于10 mL棕色容量瓶中，配成質量濃度為1 mg/mL的標準儲備液。用初始流動相將標準儲備液稀釋至適當濃度，得到標準工作溶液。上述溶液均于0～4 ℃避光保存。

1.2.2 樣品前處理提取：稱取均勻樣品1 g(精確至0.000 1 g)于50 mL聚丙烯具塞離心管中，加入20 mL乙腈-100 mmol/L甲酸/甲酸銨緩沖溶液(pH 2.5,體積比8∶2)，渦旋1 min，超聲15 min，8 000 r/min離心5 min，待凈化。

凈化：準確取5 mL提取液上Oasis PRiME HLB固相萃取柱，加1 mL乙腈淋洗，合并流出液，加水轉移定容至25.00 mL，渦旋混勻離心，過0.22 μm微孔濾膜后，待測定。

1.2.3 基質效應取空白樣品，按“1.2.2”制備空白基質溶液。分別用空白基質溶液和乙腈-10 mmol/L甲酸/甲酸銨溶液(pH 3.0,1∶9)稀釋標準儲備液，得到同濃度水平的測定液。分別測定樣品空白基質溶液與純溶劑中添加相同濃度目標成分的響應值，通過計算二者的相對比值評價基質效應(Matrix effect,ME)：ME(%)=(基質匹配標準溶液響應/無基質標準溶液響應-1)×100。

1.2.4 液相色譜條件色譜柱：Waters HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；流動相：甲醇(A)和10 mmol/L甲酸/甲酸銨緩沖溶液(pH 3.0，B)。梯度洗脫程序：0～3.0 min，2%A；3.0～5.0 min，2%～20%A；5.0～6.0 min，20%～95%A；6.0～8.0 min，95%A；8.0～8.1 min，95%～2%A；8.1～10.0 min，2%A。流速：0.3 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣體積：2 μL。

1.2.5 質譜條件離子源:噴射流電噴霧離子源(Jet ESI)；離子化模式：負離子模式(ESI-)；毛細管電壓:3.0 kV;噴嘴電壓:0 V;干燥氣溫度：250 ℃;干燥氣流速:5 L/min;霧化氣壓力：0.31 MPa;鞘氣溫度：350 ℃;鞘氣流速:11 L/min;掃描方式：多反應監測(MRM)；TMT的母離子為m/z175.8;碎裂電壓為90 V;定性離子對為175.8>116.8，碰撞能量(CE)為10 eV；定量離子對為175.8>58.1，碰撞能量為40 eV。

1.3 數據處理

通過與儀器配套的MassHunter色譜數據處理系統完成數據采集與處理，采用Origin 8.0進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 儀器條件的優化

2.1.1 質譜條件的優化TMT為帶有3個巰基的三嗪類化合物，在ESI源下易電離形成負離子。將1 μg/mL的TMT標準溶液通過蠕動泵注入質譜儀，通過一級質譜掃描獲得相應的母離子，并優化獲得最優離子源參數。

TMT存在酮式和醇式兩種同分異構體，二級全掃描結果顯示在負離子模式下，TMT主要以丟失1個質子[M-H]-離子形式存在，且該碎片較穩定不易碎裂。優化碰撞能發現，當CE低于5 eV時主要以[M-H]-準分子離子峰存在；當CE達到10 eV時，出現m/z58.1和m/z116.8碎片，推測在此能量下雜環開始斷裂，破壞穩定的環狀結構不是其最優勢反應；當CE達到40 eV時，整個環狀結構均裂得到豐度較高的m/z58.1碎片。m/z58.1為不同斷裂的疊加，響應較高且穩定，因此選擇m/z58.1為定量離子，m/z116.8為定性離子。進一步優化碎裂電壓、碰撞能量等參數，得到目標化合物的MRM質譜參數，具體見“1.2.5”。

圖1 TMT的不同存在形式及反應Fig.1 The different forms and reactions of TMT

考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-10 mmol/L甲酸/醋酸銨溶液(pH 3.0)、甲醇-10 mmol/L甲酸/甲酸銨溶液(pH 3.0)幾種流動相對目標物的分離效果。發現質子性溶劑甲醇較乙腈有更好的響應；甲醇-水不利于分子狀態TMT的形成；相同pH值條件下，甲酸銨緩沖溶液較醋酸銨緩沖溶液有更好的響應和峰形。此外，不同pH值的流動相對TMT的色譜行為影響較大，比較了pH值為2.5、3.0、4.0、5.0、6.0的甲醇-10 mmol/L甲酸/甲酸銨溶液作為流動相對目標物的分離效果。結果發現，隨著pH值的降低，色譜保留性能提高，在pH 3.0下TMT主要以H3TMT分子形式存在。綜合考慮，選擇甲醇-10 mmol/L甲酸/甲酸銨緩沖溶液(pH 3.0)為流動相。

2.2 前處理條件的優化

2.2.1 提取溶劑的選擇針對TMT在不同溶液中存在不同形式和樣品基質的特點，分別考察了甲醇、乙腈、乙腈-水(1∶1)、乙腈-1%甲酸水(1∶1)、乙腈-100 mmol/L甲酸/甲酸銨緩沖溶液(pH 3.0,1∶1)作為提取劑的提取效果。結果發現(表1)，乙腈和甲醇雖能較好地分散樣品，但對TMT提取效果差，回收率為60%～70%左右。對于小麥粉(WF)和FTA1，提取溶劑乙腈-1%甲酸水(1∶1)較乙腈-水(1∶1)的提取效率均有所提高，回收率分別從81.9%和80.3%提高至94.2%和91.3%，分析原因可能是在此酸性提取環境下TMT更趨向于分子形式，易于被提取。然而這兩種提取溶劑處理FTA2時出現成膠現象，給提取帶來了困難。可能是含玉米淀粉及各種復合酶的FTA2遇水膠化所致。

進一步比較發現，乙腈-100 mmol/L甲酸/甲酸銨緩沖溶液(pH 3.0,1∶1)可使WF和FTA1的提取回收率提高至95.5%和92.1%，對于陽性小麥粉(WF-03)的提取效率提升至10.86 mg/kg，因此緩沖鹽的加入有助于TMT總量的提取。且其處理FTA2時不膠化，分散性較好。因此，初步選擇乙腈-100 mmol/L甲酸/甲酸銨緩沖溶液(pH 3.0,1∶1)作為提取溶劑。

表1 不同提取溶劑對TMT的提取效率(n=3)Table 1 Average efficiencies of TMT with different extraction solvent(n=3)

2.2.2 提取溶劑pH值的選擇對乙腈-100 mmol/L甲酸/甲酸銨緩沖溶液(1∶1)的pH值(pH 2.0、2.5、3.0、4.0、6.5)進行考察，結果顯示，隨著pH值的降低，TMT的提取效率呈升高趨勢，pH值為2.5時小麥粉和酶式處理劑的提取效率最高(回收率分別為95.9%和81.9%)，當pH值降至2.0時提取效率呈下降趨勢。在pH 2.5的緩沖溶液中，TMT主要以分子狀態存在，提取效率提高。綜合考慮選擇提取溶劑的pH值為2.5。

2.2.3 緩沖鹽溶液濃度的優化對提取溶劑乙腈-甲酸/甲酸銨緩沖溶液(pH 2.5，1∶1)的緩沖鹽濃度(10、20、50、100、200、500 mmol/L)進行考察。結果顯示，隨著緩沖鹽濃度的升高，小麥粉中TMT的提取回收率變化不大，陽性小麥粉含量和酶式處理劑的提取效率呈升高趨勢，緩沖鹽濃度為100 mmol/L時提取效率最高，進一步提高鹽濃度提取效率略有下降。因此選擇提取溶劑的緩沖鹽濃度為100 mmol/L。

2.2.4 提取溶劑中有機相含量的優化在pH<4.8時，TMT主要以H3TMT存在，該狀態不易溶于水，因此需對提取溶劑的有機相含量進行優化。對乙腈-100 mmol/L甲酸/甲酸銨緩沖溶液(pH 2.5)中乙腈含量(40%、50%、60%、70%、80%、90%)進行考察，發現TMT的提取效率隨著有機相含量的提高而升高。乙腈含量為80%時的提取效果最好，小麥粉和酶式處理劑的加標回收率分別達99.1%和96.0%，陽性樣品的含量測定值為14.69 mg/kg。但有機相比例過高會影響緩沖溶液所提供的離子強度和pH值，導致提取效率下降，綜合考慮選擇80%的乙腈-緩沖溶液體系。綜上，確定乙腈-100 mmol/L甲酸/甲酸銨緩沖溶液(pH 2.5，8∶2)為最終提取溶劑。

圖2 不同凈化方式對TMT回收率(A)與基質效應(B)的影響Fig.2 Effect of different purification method on recoveries(A) and matrix effects(B) of TMT WF,FTA2 and WF-03 mean wheat flour,flour treatment agent 2 and the positive wheat flour,respectively

2.2.5 取樣量的選擇分別對不同取樣量(0.5、1、2、3、4 g)進行考察，結果發現隨著取樣量的增加，陽性樣品(WF-03)含量和FTA2的回收率在1 g后呈下降趨勢，過高的取樣量影響了樣品分散性和目標物的提取效率。取樣量對于FTA1和小麥粉基質的提取效率影響不大，只是在取樣量過高時(4 g)分別表現出回收率降低和偏高的情況。綜合考慮取樣代表性及方法靈敏度，對小麥粉及其添加劑均選擇1 g的取樣量。

2.2.6 凈化方式的選擇進一步比較了直接提取(A)、直接提取-稀釋(B)、PRiME HLB(C)、QuEChERS 1(D，100 mg C18+900 mg MgSO4)、QuEChERS 2(E，150 mg C18+150 mg PSA+900 mg MgSO4)和PRiME HLB-稀釋(F)6種凈化方式的凈化效果。

通過對TMT在小麥粉及添加劑中的平均回收率、陽性樣品含量及基質效應的比較(圖2A和B)可知，直接提取不凈化在回收率和基質效應上均需進一步改善。D與E為兩種QuEChERS凈化包，對WF和FTA2的回收率及WF-03含量分別為122.1%、121%、15.7 mg/kg和76.4%、82.8%、12.6 mg/kg，表現出回收率過高和偏低，方式D的回收率偏高可能是TMT基質增強引起，方式E的回收率和陽性樣品含量偏低可能是PSA對目標物有一定吸附所致。相比直接提取(A和B)和QuEChERS(D和E)，PRiME HLB(C和F)在提取效率和基質效應方面效果更好。方式F為在C基礎上進一步稀釋，在滿足靈敏度的同時，可將基質效應控制在2%以下，相對標準偏差(RSD)也低于2.1%。PRiME HLB填料具有極強水浸潤性，無需活化和平衡步驟，凈化過程只吸附雜質，目標成分不保留，操作簡單和效率高等優勢。因此，本方法選擇F為最終凈化方式。

2.2.7 定容溶劑的考察考慮到溶劑效應及TMT易存在多種離子形式，對標準工作溶液的定容溶劑進行考察。首先比較乙腈-水(1∶9)和乙腈-10 mmol/L甲酸/甲酸銨(pH 3.0,1∶9)兩種定容溶劑的影響，發現乙腈-水不能很好控制TMT的電離，色譜圖上有少量離子形式峰的存在，后者能較好控制峰形。同時比較了不同乙腈含量的定容溶劑，發現乙腈含量在50%以下時，對目標物的峰形和保留時間均無明顯影響。綜合考慮確定標準工作溶液的定容溶劑為乙腈-10 mmol/L甲酸/甲酸銨(pH 3.0,1∶9)。

2.3 基質效應

按“1.2.3”步驟對小麥粉、酶式處理劑中TMT的基質效應進行評價，結果見圖2B中方式F。研究發現，TMT在不同基質中基質效應差異不大，TMT的基質效應基本在±5%以內，完全滿足定量需求。因此，本方法采用純溶劑標準曲線定量，減少了匹配相同空白基質的難操作性及不同空白樣品匹配的差異性。

2.4 方法學評價

2.4.1 線性范圍、檢出限與定量下限將標準儲備液用乙腈-10 mmol/L甲酸/甲酸銨溶液(pH 3.0,1∶9)逐級稀釋，得質量濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、50、100、250 ng/mL的系列標準工作溶液。將該溶液以質量濃度從低到高的順序，按“1.2.4”和“1.2.5”條件進行測定，以TMT定量離子對的峰面積(Y)對其質量濃度(X,ng/mL)作標準曲線。TMT在0.5～250 ng/mL范圍內線性關系良好，線性回歸方程為Y=805.04X+120.23，r2=0.997 7。采用空白基質加標的方法，以信噪比S/N=10得到目標物的定量下限(LOQ)為0.05 mg/kg，以S/N=3得到目標物的檢出限(LOD)為0.02 mg/kg。

表2 小麥粉及添加劑中TMT的回收率及相對標準偏差(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of TMT in wheat flour and flour additives(n=6)

2.4.2 回收率與相對標準偏差分別在小麥粉、FTA1、FTA2陰性樣品中添加0.10、1.00、10.0 mg/kg 3個濃度水平的TMT標準溶液，每個濃度水平重復測定6次，按照“1.2.2”方法進行提取凈化后，采用本方法測定。TMT的平均回收率為95.0%～110%，RSD均不大于5.6%(見表2)。

2.5 實際樣品測定

應用本方法對市售及稽查的42批次小麥粉及34批次面粉添加劑樣品進行分析，面粉添加劑除了兩類復合面粉處理劑外，還涉及雙乙酰酒石酸單雙甘油酯、聚賴氨酸鹽酸鹽、葡萄糖氧化酶、維生素C、酒石酸氫鉀、皂莢糖膠等多種單一添加劑類別，方法適用性較好。其中有3批次小麥粉樣品檢出TMT，含量分別為0.221、2.25、14.6 mg/kg，面粉添加劑樣品均未檢出，陽性小麥粉的色譜圖見圖3。

3 結 論

本文建立了適用于小麥粉及其添加劑中TMT總量的超高效液相色譜-串聯質譜測定方法。樣品經乙腈-甲酸/甲酸銨緩沖溶液提取，采用無需活化的通過式Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化，克服了面粉處理劑基質特殊性和TMT存在形式多樣性帶來的提取效率低的難題，實現了小麥粉及其添加劑中TMT總量的痕量檢測。該方法樣品前處理簡便快速，定性、定量準確，靈敏度高，可滿足小麥粉及其添加劑中非食用物質TMT總量的快速檢測，可為進一步加強小麥粉質量控制提供技術支持。