超高效合相色譜-串聯質譜法定量檢測食用植物油中12種長鏈甘油三酯

楊光勇，郭蒼亭，薛 光，郭金喜

(1.新疆維吾爾自治區產品質量監督檢驗研究院，新疆 烏魯木齊 830011；2.烏魯木齊市 疾病預防控制中心，新疆 烏魯木齊 830026)

食用植物油是人體攝取亞麻酸等生物活性物質的重要來源，亦是醫藥、食品加工等行業獲取油脂原料的主要方式，高品質的食用植物油是確保人體營養健康和產品質量安全的重要保證。甘油三酯(Triacylglycerols,TAGs)是植物油的主要成分，不同結構的TAGs對人體的生理作用存在很大差別[1-2]。因此，準確測定食用植物油中各TAGs的含量對于評價油脂品質、保障消費者飲食營養健康等具有重要意義。

目前，油脂中TAGs的檢測方法主要有高溫氣相色譜法[3-4]、液相色譜法[5-6]、多維色譜法[7-8]、高溫氣相色譜-質譜法[9-10]、液相色譜-質譜法[11-13]、高分辨質譜直接進樣法[14-16]等。由于多不飽和脂肪鏈在高溫下極易發生熱裂解，因此高溫氣相色譜僅能用于分離飽和度較高的TAGs。液相色譜法存在污染排放高、方法開發難度大、分析時間長、分離效率較低等問題。多維色譜法能有效改善TAGs的分離效果，但操作繁雜，當使用兩種不同的保留機理進行分析時，還需考慮兩維溶劑的兼容性，難以實現高通量分析。高分辨質譜直接進樣法分析速度快、通量高，但該法未對樣品進行色譜分離，測定時各TAGs會相互干擾，影響定量結果的準確性，且所用設備較為昂貴，不易普及。超高效合相色譜(Ultra performance convergence chromatography,UPC2)是以超臨界CO2為主要流動相的色譜系統，具有分離效率高、分析條件溫和等優勢，可有效彌補以上方法的不足，已被成功應用于TAGs的定性鑒別[17-18]、脂溶性化合物的定量分析[19-20]等方面。

食用植物油中TAGs的種類繁多，使定量檢測工作變得異常困難，因此現有的大多數研究均采用面積歸一化法計算各組分的相對含量。但一些研究[21-22]及本實驗均發現，TAGs分子上的脂肪酰碳鏈長度與不飽和度對其離子化效率有很大影響，如果分析時僅考慮峰面積而忽略質譜響應差異，則會使定量結果出現很大偏差，無法反映樣品中各TAGs的真實含量。針對以上情況，本文首次采用UPC2-MS/MS結合外標法對食用植物油中12種長鏈TAGs進行檢測和精確定量，各TAGs的分離效果良好，定量結果準確，為測定食用植物油中甘油酯類化合物提供了綠色環保、準確高效的新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UPC2-TQS超高效合相色譜-三重四極桿質譜儀(美國Waters公司),XS205DU電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘油酯(PLO)、三亞油酸甘油酯(LLL)、1,2-亞油酸-3-油酸甘油酯(LLO)、1,2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯(LLP)、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯(POL)、1,2-油酸-3-棕櫚酸甘油酯(OOP)、1,2-油酸-3-亞油酸甘油酯(OOL)、三油酸甘油酯(OOO)、1,2-亞麻酸-3-亞油酸甘油酯(LLnLn)、1,2-亞油酸-3-亞麻酸甘油酯(LLLn)、1,2-亞麻酸-3-油酸甘油酯(OLnLn)、1,2-亞油酸-3-硬脂酸甘油酯(LLS)標準品購自美國Nu-Chek公司、Sigma-Aldrich公司、加拿大TRC公司；正己烷、甲醇為色譜純，購自美國Thermo Fisher公司；甲酸、氨水(25%～28%)為優級純，購自Sigma-Aldrich公司。食用植物油樣品購自市場。

1.2 實驗方法

1.2.1 儀器條件色譜條件：色譜柱為兩支串聯的HSS C18SB柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；柱溫為40 ℃；流動相：A為超臨界CO2，B為甲醇(含0.1%甲酸)；流速為1.5 mL/min。洗脫梯度程序：0～1.0 min，0.2%B；1.0～9.0 min，0.2%～4.0%B；9.0～10.0 min，4.0%～20%B；10.0～13.0 min，20%B；13.0～14.0 min，20%～0.2%B。系統背壓為12.76 MPa；進樣體積為5 μL。

質譜參數:電噴霧電離源，正離子(ESI+)、多反應監測(MRM)模式；離子源溫度:150 ℃；去溶劑氣：流速750 L/h，溫度300 ℃；毛細管電壓為2.0 kV；補償液為97%甲醇水溶液(含0.2%氨水)，流速為0.3 mL/min。12種TAGs的保留時間、母離子和子離子見表1。

表1 12種TAGs的保留時間、母離子及子離子Table 1 Retention times,parent ions and daughter ions of the 12 kinds of TAGs

*quantitative ion

1.2.2 標準品與樣品溶液的制備標準品溶液：準確稱取12種TAGs標準品各50.0 mg，分別用正己烷制成10 g/L的單標儲備液；再準確吸取各單標儲備液1 mL至100 mL容量瓶中，用正己烷稀釋并定容至刻度，制成各組分質量濃度均為100 mg/L的混合標準溶液。上述溶液保存于-18 ℃冰箱。

樣品溶液：稱取充分混勻的食用植物油0.1 g(精確至0.000 1 g)，用正己烷溶解并定容至100 mL，再準確吸取該溶液1 mL，用正己烷稀釋至100 mL，過0.22 μm濾膜。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇12種TAGs均為長鏈脂肪酸酯，各TAGs之間的結構和極性極為相似，多個化合物的母離子及部分子離子的質荷比(m/z)均相同，給選擇色譜柱帶來一定難度。實驗考察了3種填料的UPC2色譜柱：HSS C18SB(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、Torus 1-AA(100 mm×3.0 mm,1.8 μm)、BEH(100 mm×3.0 mm,1.8 μm)對12種TAGs分離效果的影響。其中HSS C18SB色譜柱是經過改進的反相色譜柱，對酯類化合物具有很好的保留能力；Torus 1-AA色譜柱的填料為鍵合1-氨基蒽的硅膠顆粒，可提供偶極、誘導偶極、π-π等多種作用，具有較好的選擇性；BEH色譜柱填裝了亞乙基橋雜化顆粒，對各TAGs單體間的極性差異較為敏感。結果表明，選用BEH色譜柱時各組分的色譜峰均互相包埋或形成肩峰；Torus 1-AA色譜柱無法分離互為位置異構體的目標化合物；HSS C18SB色譜柱對各TAGs的分離效果最為明顯，但經優化其他色譜條件后仍無法實現POL和PLO的基線分離。因此，實驗選擇串聯兩支HSS C18SB色譜柱(總長度為200 mm)進行測定。

2.1.2 色譜柱溫度及系統背壓的選擇色譜柱溫度和系統背壓的變化會改變超臨界CO2的密度，從而影響其洗脫能力。通常情況下，隨著柱溫升高、背壓減小，流動相的密度變小，化合物的保留時間延長，但柱溫升高會增大分子的能量，縮短化合物的保留時間。因此，柱溫對化合物的保留行為具有雙重影響。分別考察了不同柱溫(20、30、40、50、60 ℃)、不同背壓(12.07、12.76、13.45、14.13 MPa)對12種TAGs分離效果的影響。結果表明，隨著柱溫升高，各TAGs的分離趨勢增加，當柱溫超過40 ℃后，分離趨勢反而降低;各組分的分離效果并未隨系統背壓的改變而出現明顯變化。綜合考慮分離度、系統壓力極限等因素，選取柱溫為40 ℃，系統背壓為12.76 MPa。

2.1.3 流動相改性劑的選擇為改變超臨界CO2對化合物的溶解和洗脫能力，需在流動相中引入適量甲醇、乙腈等溶劑作為改性劑。常用改性劑在UPC2中的洗脫能力大小為：甲醇>異丙醇>乙腈。為獲得最佳色譜峰形，實驗選用洗脫強度較高的甲醇作為改性劑。同時，為消除游離脂肪酸等化合物與未鍵合硅醇羥基的氫鍵作用，降低其色譜峰拖尾對TAGs測定的干擾，在甲醇改性劑中加入0.1%甲酸，并進一步優化洗脫梯度。

圖1 12種TAGs混合標準溶液(5 mg/L) 的提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion current chromatogram of the 12 kinds of TAGs mixed standard solution(5 mg/L) peak numbers denoted were the same as those inTable 1

圖2 補償液中氨水(A)和純水(B)的體積分數 對2種TAGs峰高的影響Fig.2 Effects of volume fraction of ammonium hydroxide(A) and water(B) in compensation solution on the peak heights of the 2 kinds of TAGs the numbers denoted were the same as those inTable 1

在優化色譜條件下，利用UPC2-MS/MS對12種TAGs混合標準溶液(5 mg/L)進行掃描，其提取離子流色譜圖見圖1。

2.2 質譜條件的優化

2.2.1 采集參數的確定將各標準儲備液用含0.2%氨水的甲醇溶液適當稀釋后，依次注入三重四極桿質譜儀，開啟儀器自動優化功能，采用自動優化所得的錐孔電壓、碰撞能量和駐留時間等參數。

2.2.2 補償液組成及流速的優化補償液由柱塞泵輸送至色譜柱后端，主要用于傳輸化合物至質譜儀，并促使其離子化。補償液不參與色譜分離，但其流速和組成對化合物的色譜峰形、離子化效率等均有較大影響。為獲得較好的響應強度，實驗選用質子化試劑甲醇作為補償液，并在甲醇中加入添加劑以促進TAGs離子加合物的形成。張星河等[18]的研究證實，TAGs的銨加合物具有較好的質譜響應。因此，實驗以不飽和度差異最大的LLnLn和OOP為研究對象，考察了含不同體積分數氨水(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)的甲醇補償液在不同流速(0.1、0.2、0.3、0.4 mL/min)下對測定結果的影響。結果表明，當補償液流速為0.3 mL/min，氨水體積分數為0.2%時，目標化合物的色譜峰形和響應達到最佳(見圖2A)。

此外，實驗發現在含0.2%氨水的甲醇補償液中加入適量純水可進一步提高方法的靈敏度，比較了添加不同含量(1%、2%、3%、4%、5%、6%)純水時目標化合物的峰高(圖2B)，可知純水的最佳含量為3%；當純水含量超過5%后，系統壓力波動明顯，設備不穩定，可能因為水的高比熱容使系統動態背壓閥無法正?？販?，或管路中形成雙相流動相所致。

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性范圍、檢出限與定量下限用正己烷配制各組分質量濃度均為0.030、0.035、0.10、0.25、0.75、2.5、5.0、10、20 mg/L的系列混合標準溶液，經UPC2-MS/MS測定后，以目標物的定量離子峰面積為縱坐標(y)，對應質量濃度為橫坐標(x，mg/L)繪制標準曲線。結果表明，12種TAGs在相應的質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數(r2)≥0.990 2。稱取適量樣品，按“1.2.2”處理后進行測定，以測試溶液中各目標化合物的信噪比(S/N)分別為3和10時計算檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，12種TAGs的LOD和LOQ分別為1.0～8.0 mg/g和3.0～25 mg/g(見表2)。

2.3.2 回收率與相對標準偏差稱取0.05 g(精確至0.000 1 g)亞麻籽油樣品，加入適量標準儲備液，使處理后的最終測試溶液中LLnLn、LLLn、OLnLn、OOP的加標濃度為500 μg/L，其他TAGs的加標濃度為50 μg/L。共制備9份加標樣品進行測定，得到平均回收率(n=9)為95.7%～104%，相對標準偏差(RSD)為1.5%～4.2%(見表2)。

表2 12種TAGs的線性關系、檢出限、定量下限、回收率與相對標準偏差Table 2 Linear relations,LODs,LOQs,recoveries and RSDs of the 12 kinds of TAGs

y:peak area;x:mass concentration,μg/L;the numbers denoted were the same as those in
Table 1

取混合標準溶液(500 μg/L)，按“1.2.1”方法連續進樣6針，得到12種TAGs峰面積的RSD(n=6)為0.48%～1.9%，保留時間的RSD(n=6)為0.12%～0.96%。將上述混合標準溶液連續測定5 d，每天進樣1次，得到各TAGs峰面積的RSD(n=5)為1.1%～2.7%，保留時間的RSD(n=5)為0.90%～2.3%，表明儀器的日內和日間精密度均良好。

表3 樣品中12種TAGs的含量(mg/g)Table 3 Contents of 12 kinds of TAGs in the samples(mg/g)

-:less than LOQ;the numbers denoted were the same as those in
Table 1

2.4 實際樣品的測定

按照建立的方法對6份食用植物油樣品進行分析，以外標法定量。12種TAGs在菜籽油、花生油、亞麻籽油中的含量見表3。由表3可知，各品種植物油中12種TAGs含量差異較大。其中，花生油和菜籽油中OOO的含量最高，其次為OOL，而低不飽和度的甘油三酯含量較低;亞麻籽油中則含有豐富的高不飽和度甘油三酯(如OLnLn、LLnLn等)。

3 結 論

本文采用UPC2-MS/MS建立了食用植物油中12種長鏈TAGs含量的檢測方法，并對考察范圍以外的其他TAGs進行了分析。該法快速準確，靈敏度高，專屬性好，綠色環保，基質兼容性強，可有效分離當量碳數相同甚至互為位置異構體的TAGs，較傳統方法極具優勢，對保障植物油食用安全、評價其物理化學性質及營養價值等具有重要意義。該法也可用于食用植物油中其他酯類化合物的測定。

圖3 亞麻籽油樣品的提取離子流色譜圖(A，m/z=869.3)及保留時間分別為4.91 min(B)、 5.03 min(C)化合物的子離子掃描圖Fig.3 Extracted current chromatogram of the flaxseed oil(A，m/z=869.3),product ion scan spectra of the compound with retention time of 4.91 min(B) and 5.03 min(C)