液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜鑒定一種新精神活性物質(zhì)5F-MDMB-PICA在斑馬魚(yú)體內(nèi)的代謝產(chǎn)物

岳琳娜，嚴(yán) 慧，向 平，劉 偉*，宋粉云

(1.廣東藥科大學(xué)，藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.司法鑒定科學(xué)研究院，法醫(yī)毒物化學(xué)研究室，上海 200063)

新精神活性物質(zhì)又稱“第三代毒品”，是不法分子通過(guò)對(duì)管制毒品進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，或全新設(shè)計(jì)和篩選而獲得的毒品類似物，具有與管制毒品相似或更強(qiáng)的危害性。合成大麻素(Synthetic cannabinoids,SCs)是模擬大麻植物主要活性成分四氫大麻酚(Δ9-THC)的化學(xué)作用而合成的一類化合物，通常具備更強(qiáng)大的危害性和成癮性。據(jù)歐洲毒品和毒癮監(jiān)測(cè)中心(EMCDDA)報(bào)道：合成大麻素類是種類最多、濫用最為嚴(yán)重的一大類新精神活性物質(zhì)[1]。

5F-MDMB-PICA(Methyl 2-[[1-(5-fluoropentyl)indole-3-carbonyl]amino]-3,3-dimethyl-butanoate)，中文名稱3，3-二甲基-2-[1-(5-氟戊基)吲哚-3-甲酰氨基]丁酸甲酯，屬于具有吲哚母核的新型合成大麻素衍生物[2-4]，其活性是Δ9-THC的380倍[5]。5F-MDMB-PICA在娛樂(lè)用途上越來(lái)越流行[6]，據(jù)美國(guó)國(guó)家法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)(NFLIS)報(bào)告，2016年～2018年間，已有340份報(bào)告包含5F-MDMB-PICA[7]。5F-MDMB-PICA引發(fā)了許多健康問(wèn)題，包括胸痛、呼吸系統(tǒng)疾病、癲癇發(fā)作甚至造成死亡[8-9]。2018年，5F-MDMB-PICA在美國(guó)被列入管制列表[7]。目前5F-MDMB-PICA在我國(guó)尚未列入管制清單,鑒于其強(qiáng)效作用及可能的濫用趨勢(shì)，可能會(huì)對(duì)公共安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

合成大麻素的母體結(jié)構(gòu)通常很難在生物基質(zhì)中檢出，因此需要進(jìn)行代謝研究，以便對(duì)新出現(xiàn)的合成大麻素濫用形勢(shì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。Mogler等[10]通過(guò)人肝微粒體體外代謝模型研究5F-MDMB-PICA代謝產(chǎn)物，分析了吸毒者的尿樣(n=24)，鑒定出12種I期代謝物。Truver等[11]通過(guò)人肝細(xì)胞孵育對(duì)5F-MDMB-PICA的體外代謝進(jìn)行研究，共鑒定出22個(gè)代謝產(chǎn)物。盡管有5F-MDMB-PICA體內(nèi)和體外代謝研究的信息，但對(duì)于這類物質(zhì)的監(jiān)測(cè)仍缺乏系統(tǒng)的體內(nèi)分析方法和代謝數(shù)據(jù)的支撐。

近年來(lái)，斑馬魚(yú)(Zebrafish)在毒理學(xué)、藥物篩選、行為遺傳學(xué)和藥物代謝等各個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛[12-14]。斑馬魚(yú)與人的基因高度相似，同源性高達(dá)87%[15-16]。斑馬魚(yú)體內(nèi)有內(nèi)源性大麻素受體1(CB1)和大麻素受體2(CB2)，具有同人類及其他哺乳動(dòng)物高度相似的藥物代謝的相關(guān)酶，包括Ⅰ相代謝酶[17]和Ⅱ相代謝酶[18]。作為一個(gè)完整的生物，斑馬魚(yú)也能彌補(bǔ)體外模型系統(tǒng)在藥物代謝研究方面的局限性。已有報(bào)道采用斑馬魚(yú)模型進(jìn)行合成大麻素N-{[1-(環(huán)己基甲基)-1H-吲唑-3-基]羰基} -3-甲基-L-纈氨酸甲酯 (MDMB-CHMINACA)[19]、3-甲基-2-[1-(4-氟芐基)吲唑-3-甲酰氨基]丁酸甲酯(AMB-FUBINACA)[20]的體內(nèi)代謝研究，研究表明斑馬魚(yú)可作為代謝研究的理想實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀１疚闹荚跇?gòu)建5F-MDMB-PICA斑馬魚(yú)體內(nèi)的代謝模型，建立高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析方法探索其在斑馬魚(yú)體內(nèi)的代謝方式及代謝途徑，以期為其濫用提供方法和數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜系統(tǒng)：UltiMate 3000 UHPLC，質(zhì)譜儀：Thermo ScientificTM Q-ExactiveTM組合型四極桿 Orbitrap(LC-Q-Orbitrap MS)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(HESI-Ⅱ)及XcaliburTM3.1工作站；TDZ4-WS離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)有限公司)；XW-80A渦旋混合器(上海醫(yī)大儀器有限公司)；Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)；Minspin高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；超聲波清洗器(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)。

5F-MDMB-PICA標(biāo)準(zhǔn)品(1 mg/mL,溶劑為甲醇，美國(guó)Cayman公司)；乙腈、甲醇(≥99.9%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；甲酸、乙酸銨(98%，瑞士Fluka化學(xué)公司)；超純水使用Mili-Q系統(tǒng)制備。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將6條成年斑馬魚(yú)隨機(jī)分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組兩組，每組3條。空白對(duì)照組為不添加5F-MDMB-PICA的斑馬魚(yú)組，排除斑馬魚(yú)體內(nèi)、水中以及實(shí)驗(yàn)試劑對(duì)原體化合物及代謝物的干擾。將5F-MDMB-PICA溶解于水中，斑馬魚(yú)在5F-MDMB-PICA(1 μg/mL)藥液中暴露染毒24 h，隨后轉(zhuǎn)移到清水中清洗3次，安樂(lè)死處理后進(jìn)行樣品前處理。

1.3 樣品前處理

將斑馬魚(yú)放入2 mL規(guī)格研磨管中，加入適量陶瓷珠，乙腈溶液300 μL，于Omni Bead Ruptor 24 Elite多功能樣品均質(zhì)器中冷凍研磨。研磨參數(shù)設(shè)置為：速度6 m/s，研磨時(shí)間20 s，停留時(shí)間40 s，循環(huán)10次。然后以12 500 r/min離心3 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm PTFE微孔濾膜過(guò)濾后，裝入進(jìn)樣瓶待儀器分析。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1 液相色譜條件色譜分離采用Agilent Eclipse plus C18柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μm)，流速為0.3 mL/min；流動(dòng)相A為20 mmol/L乙酸銨、5%(體積比)乙腈和0.1%(體積比)甲酸混合溶液，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫設(shè)置為0 ～ 0.5 min，5% B；0.5 ～ 6.5 min，5%～95% B；6.5 ～ 11.5 min，95% B；進(jìn)樣量為5 μL；自動(dòng)進(jìn)樣盤的溫度為4 ℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件采用電噴霧電離正離子檢測(cè)(ESI+)模式；噴霧電壓為3.5 kV；離子傳輸管溫度為350 ℃；鞘氣流量為35 arb(arbitrary units)；輔助氣流量為10 arb;鞘氣、輔助加熱氣和碰撞氣均采用高純氮?dú)猓粩?shù)據(jù)采集模式采用一級(jí)全掃描和自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)掃描(Full MS scan-ddMS2)。

一級(jí)掃描數(shù)據(jù)采集參數(shù)設(shè)置為：分辨率為70 000，質(zhì)荷比掃描范圍為100～1 000m/z；自動(dòng)增益控制(AGC)為3.0×106；最大注射時(shí)間(IT)為50 ms。二級(jí)掃描數(shù)據(jù)采集參數(shù)設(shè)置為：分辨率為17 500；自動(dòng)增益控制(AGC)為1×105；最大注射時(shí)間(IT)為50 ms；歸一化碰撞能量(Normalized collision energy，NCE)分別為20、40、60 eV。

使用XcaliburTM3.1工作站及Mass Frontier軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。代謝產(chǎn)物的推斷依據(jù)為：m/z測(cè)量值與m/z理論值的質(zhì)量偏差小于±5 ppm，適當(dāng)?shù)纳V峰和保留時(shí)間，MS2質(zhì)譜圖中的特征碎片離子，以及結(jié)合已報(bào)道的5F-MDMB-PICA及其結(jié)構(gòu)類似物的代謝轉(zhuǎn)化的文獻(xiàn)。

2 結(jié)果與討論

本研究在斑馬魚(yú)體內(nèi)檢測(cè)到5F-MDMB-PICA的22個(gè)代謝產(chǎn)物，包括15個(gè)Ⅰ相代謝產(chǎn)物和7個(gè)Ⅱ相代謝產(chǎn)物，其中 6個(gè)Ⅱ相代謝產(chǎn)物A1、A3、A5、A6、A7、A14為首次報(bào)道。22個(gè)代謝產(chǎn)物的質(zhì)荷比m/z測(cè)得值與理論值的質(zhì)量偏差均在±5 ppm以內(nèi)。5F-MDMB-PICA的保留時(shí)間為7.18 min,22種代謝物的保留時(shí)間為4.18 ～ 6.44 min，根據(jù)保留時(shí)間將22個(gè)代謝產(chǎn)物標(biāo)記為A1～A22(見(jiàn)表1)。5F-MDMB-PICA的Ⅰ相代謝產(chǎn)物和Ⅱ相代謝產(chǎn)物的色譜圖及質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1和圖2，5F-MDMB-PICA在斑馬魚(yú)體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化途徑見(jiàn)圖3。

在22種代謝產(chǎn)物中，羥基化代謝產(chǎn)物有3種(A21、A6、A14)，脫烷基化代謝產(chǎn)物有5種(A17、A1、A3、A2、A13)，酯水解代謝產(chǎn)物有8種(A19、A12、A8、A22、A9、A11、A15、A10),氧化脫氟代謝產(chǎn)物有3種(A7、A18、A20)，酰胺水解代謝產(chǎn)物有2種(A4、A5)，羧基化代謝產(chǎn)物有1種(A16)。

表1 5F-MDMB-PICA在斑馬魚(yú)體內(nèi)產(chǎn)生的22種代謝產(chǎn)物Table 1 22 metabolites of 5F-MDMB-PICA in zebrafish

*：MS-MS was not available due to low abundance(未獲得二級(jí)質(zhì)譜圖)

圖1 斑馬魚(yú)體內(nèi)5F-MDMB-PICA及其I相代謝產(chǎn)物的色譜圖及質(zhì)譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms and MS spectra of 5F-MDMB-PICA and phase-I metabolites of 5F-MDMB-PICA in zebrafish

圖2 斑馬魚(yú)體內(nèi)5F-MDMB-PICA的II相代謝產(chǎn)物的色譜圖及質(zhì)譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms and MS spectra of phase-Ⅱ metabolites of 5F-MDMB-PICA in zebrafish

2.1 脫烷基化代謝產(chǎn)物的分析

A17是5F-MDMB-PICA脫烷基后產(chǎn)生的代謝物,測(cè)得其m/z為289.154 39，其質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了m/z為144.044 49和257.128 27的特征碎片離子。A17的響應(yīng)強(qiáng)度最高，為主要的代謝產(chǎn)物之一。生物樣本中A17的檢出不足以推斷5F-MDMB-PICA的攝入，因?yàn)槠淇梢酝ㄟ^(guò)2-[1-(4-氟丁基)-1H-吲哚-3-甲酰氨基]3,3-二甲基丁酸甲酯(4F-MDMB-BICA)的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生[21]。

A2、A13 的m/z分別為305.149 57和305.149 66，其與A17 相比分子質(zhì)量分別增加了15.995 18，15.995 27，推測(cè)是A17分子中增加了1個(gè)氧原子為羥基化代謝物。結(jié)合A2、A13的MS2質(zhì)譜圖中分別出現(xiàn)了m/z為160.039 46和160.039 41的碎片離子,說(shuō)明羥基化反應(yīng)發(fā)生在吲哚環(huán)上，但難以確認(rèn)羥基化的具體位點(diǎn)，故A2、A13是兩個(gè)羥基化的同分異構(gòu)體。

A1的m/z為481.182 04，比A2或A13增加了176 Da，生成了特征碎片離子m/z160.039 20，推測(cè)A1為A2或A13與葡萄糖醛酸結(jié)合得到的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。

A3是A2或A13與硫酸共軛得到的Ⅱ相代謝物，測(cè)得其m/z為385.105 38，與A2或A13相比相對(duì)分子質(zhì)量增加了80 Da，其主要碎片離子為m/z160.039 44(圖2)。

2.2 酯水解代謝產(chǎn)物的分析

代謝物A19的m/z為363.207 70，比原型化合物5F-MDMB-PICA(m/z377.223 14)減小了14.015 44 Da，結(jié)合m/z為232.113 14、144.043 87碎片離子的結(jié)構(gòu)，推測(cè)其是由原型酯水解得到的代謝產(chǎn)物。研究證實(shí)與5F-MDMB-PICA結(jié)構(gòu)相似的合成大麻素2-[1-(4-氟丁基)-1H-吲唑-3-甲酰氨基]-3,3-二甲基丁酸甲酯(4F-MDMB-BINACA)[22],3,3-二甲基-2-[1-(5-氟戊基)吲唑-3-甲酰氨基]丁酸甲酯(5F-MDMB-PINACA)[23],3,3-二甲基-2-[1-(4-戊烯-1-基)-1H-吲唑-3-甲酰氨基]丁酸甲酯(MDMB-4en-PINACA)[24-25]的主要生物轉(zhuǎn)化途徑有酯水解，且酯水解代謝產(chǎn)物常被推薦作為毒性標(biāo)記物。與此相同，酯水解(A19)也是5F-MDMB-PICA的主要生物轉(zhuǎn)化方式，其在斑馬魚(yú)體內(nèi)的濃度較大，是斑馬魚(yú)體內(nèi)主要的代謝物之一(表1)。已有報(bào)道在多名5F-MDMB-PICA濫用者的尿樣中均檢出代謝物A19[10-11]，且與Ⅱ相代謝產(chǎn)物相比，Ⅰ相代謝物的檢測(cè)無(wú)需經(jīng)過(guò)酶水解等復(fù)雜的前處理過(guò)程，更適宜作為監(jiān)測(cè)合成大麻素?cái)z入的生物標(biāo)記物，因此推薦A19作為檢測(cè)5F-MDMB-PICA攝入的潛在毒性標(biāo)志物。

A8的m/z為539.242 31，比A19增加了176 Da，其碎片離子m/z232.112 96、144.044 56與A19相同，推測(cè)A8為A19與葡萄糖醛酸結(jié)合得到的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。

代謝物A12(m/z379.202 67)與A19的準(zhǔn)分子離子相比相差15.994 97 Da，結(jié)合m/z為248.107 71、144.044 42碎片離子的結(jié)構(gòu)，說(shuō)明羥基化反應(yīng)發(fā)生在5-氟戊基側(cè)鏈上，但難以確認(rèn)羥基化的具體位點(diǎn)。

A22的m/z為361.191 99，比A19減小了2.015 71 Da，結(jié)合m/z為232.113 14、144.044 63碎片離子的結(jié)構(gòu)，推測(cè)A22是由A19脫氫得到的代謝產(chǎn)物。A9是由A22脫烷基得到的代謝物，產(chǎn)生了m/z為144.044 46的特征碎片離子。

A11的m/z為361.212 83，與A19相比減小了1.994 87 Da，結(jié)合m/z為230.117 49、144.043 95碎片離子的結(jié)構(gòu)，推測(cè)A11是由A19發(fā)生氧化脫氟反應(yīng)得到的代謝物。代謝物A10，測(cè)得其m/z為375.191 25，結(jié)合m/z為244.096 69、144.044 53的特征碎片離子，推測(cè)A10是由A11發(fā)生氧化反應(yīng)得到的戊酸代謝物。

A15的m/z為359.195 43，與A11相比減小了2.017 4 Da，結(jié)合已報(bào)道的5F-MDMB-PICA在肝微粒體孵育中代謝轉(zhuǎn)化途徑[11]，推測(cè)A15是由A11脫氫后得到的代謝物。由于響應(yīng)太低，未獲得A15的MS2質(zhì)譜圖。

2.3 羥基化代謝產(chǎn)物的分析

A21的m/z為393.218 32，比原型增加了15.995 18 Da，結(jié)合m/z為248.107 99、144.044 27碎片離子的結(jié)構(gòu)，可知羥基化的發(fā)生位點(diǎn)是5-氟戊基側(cè)鏈，但難以確定具體位點(diǎn)。A6的m/z569.250 49與A21相比增加了176 Da，推測(cè)是由A21與葡萄糖醛酸結(jié)合得到的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。A14的m/z為473.175 29，比A21增加了80 Da，其m/z為248.108 11、144.044 65的特征碎片離子與A21一致，推測(cè)是由A21與硫酸結(jié)合得到的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。

2.4 氧化脫氟代謝產(chǎn)物的分析

A20的m/z為375.227 78，比原型5F-MDMB-PICA減小了1.995 36 Da，結(jié)合m/z為144.044 42、230.117 55的特征碎片離子，推測(cè)是由原型發(fā)生氧化脫氟反應(yīng)得到的代謝物。A20進(jìn)一步氧化生成戊酸A18，產(chǎn)生了m/z為244.096 66、144.044 24的特征碎片離子。

代謝物A7，測(cè)得其m/z為551.260 56，與A20相比增加了176 Da，m/z為230.117 54、144.044 45的特征碎片離子與A20一致，推測(cè)A7是由A20與葡萄糖醛酸結(jié)合得到的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。

2.5 酰胺水解代謝產(chǎn)物的分析

5F-MDMB-PICA酰胺鍵水解后生成代謝物A4，測(cè)得其m/z為250.123 61。產(chǎn)生了m/z為206.134 03、118.065 10的特征碎片離子。

A5的m/z為426.154 47，與A4相比增加了176 Da，其m/z為206.134 17的特征碎片離子與A4一致，推測(cè)A5是由A4與葡萄糖醛酸結(jié)合得到的Ⅱ相代謝產(chǎn)物。

2.6 羧基化代謝產(chǎn)物的分析

A16的m/z為361.174 53，與原體相比減小了16.048 61 Da，結(jié)合已報(bào)道的5F-MDMB-PICA的代謝轉(zhuǎn)化途徑[10-11]，推測(cè)A16是由原型發(fā)生氧化脫氟反應(yīng)后得到的丙酸代謝產(chǎn)物。由于響應(yīng)太低，未獲得A16的MS2質(zhì)譜圖。

3 結(jié) 論

5F-MDMB-PICA等合成大麻素在人體內(nèi)代謝速率較快，在尿液中基本無(wú)原藥檢出，這為該類毒品濫用的監(jiān)測(cè)工作帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)。本文采用液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)，通過(guò)近年來(lái)藥物代謝研究中較為流行的斑馬魚(yú)模型，研究鑒定出了5F-MDMB-PICA的22個(gè)代謝產(chǎn)物及主要代謝途徑，其中6個(gè)Ⅱ相代謝產(chǎn)物為首次報(bào)道。本研究獲得的5F-MDMB-PICA體內(nèi)代謝數(shù)據(jù)、開(kāi)發(fā)的5F-MDMB-PICA及代謝物的分析方法可應(yīng)用于5F-MDMB-PICA的濫用監(jiān)測(cè)，為臨床上5F-MDMB-PICA的中毒診治提供依據(jù)，也為法庭科學(xué)案件中這種新型精神活性物質(zhì)濫用的打擊和預(yù)防提供了技術(shù)支持。